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外植体褐化的发病机制及防治 在植物组织培养中提到的黄褐色是指在外植体诱导初始分化或再分的过程中，自身组织从表面向培养基释放棕色物质，培养基逐渐转化为棕色，外植体随后褐死。褐化现象主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变，而且对许多酶有抑制作用，影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致材料死亡。褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难，因此，有人认为，褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。 1 褐变的酶底物 褐化分为酶促褐化和非酶促褐化。非酶促褐化是由于细胞受胁迫条件或其他不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而导致的褐化，其中未涉及到酚类物质的产生。酶促褐化是因为酚类物质的参与而引起的褐化现象。目前认为植物组织培养中的褐化主要是酶促褐化。 酶促褐化必须具备酶、底物和氧3个条件。引起褐化的酶有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PLA）等，而目前普遍认可的诱发褐化的酶类是多酚氧化酶。PPO是一种含铜酶，它的活性依赖于铜的氧化还原作用。该酶适宜反应体系的pH范围为5.8～6.8，其不耐热，40℃以下活性稳定，45℃以上活性迅速下降。PPO可以催化2种不同的反应，即催化含1个羟基的酚形成二醌和催化邻苯二酚形成二醌。引起褐变的酶底物主要是酚类化合物，它是植物界中种类最多、分布最广的次生代谢物质之一。酚类物质的共同结构特点是含有带羟基的苯环结构，按其组成结构可分为苯基羧酸类（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等）、苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等）、黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等）三大类。酚类物质是一类有害的次生代谢产物，在植物细胞中能与蛋白质或酶发生氢键缔合，能与许多金属离子络合，其氧化产物醌在植物细胞内既能自我聚合，也能与含有羟基、氨基和巯基之类的化合物发生反应而产生有色物质，导致组织的褐变。 酶和底物的深入研究已经为酶促反应体系理论的研究奠定了基础。Mayer在进行组织培养时发现，酚类物质的含量与其褐变率成正相关，提出了果实组织细胞中酚类物质和PPO的区域化分布假说，认为在正常发育的植物组织中，底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，这是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。当细胞膜的结构发生变化和破坏时，就为酶与PPO的接触创造了条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐化。鞠志国证实，莱阳梨细胞中的酚类物质集中于液泡，而PPO则主要分布于细胞质中，并且果实内总酚含量与其褐变密切相关。陈秀芳等在研究果实成熟过程中某些酚含量和PPO活性变化的关系时，证明了褐变程度与总酚含量以及PPO活性之间存在一定的关系，但因品种而异。而罗晓芳等的研究表明，多酚氧化酶的活性与组织培养材料的褐变不呈正相关，但酚类物质的总含量与褐变有一定的关系，同时易褐变材料的褐变程度随培养时间的延长不断增加。 2 外植体生理特性及成因 引起组织培养过程中外植体褐变的因素包括2个方面：一是外植体自身的原因，包括外植体的生理状态、生长状态、遗传特性等；二是外植体所处的培养环境，包括培养基的成分及培养条件。 2.1 花药培养中愈伤组织的诱导 在植物组织培养中，不同物种之间褐化程度差异很大，就是同种植物的不同品种间也存在一定差异。如橡胶树的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织诱导容易，而有些品系花药容易褐化，诱导困难；银杏的众多品系中，佛手品系比梅核品系愈伤组织诱导困难。这些可能是由于外植体的基因型差异引起的。 2.2 褐化、褐化材料的研究 邱璐等研究发现，用桑树基部发出的幼芽作外植体比用上部壮枝上的壮芽作外植体褐化轻、褐化率低；幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低。Gannoun等报道，阿月浑子2年和4年生材料的组织培养获得成功，但8年和26年生材料则出现褐化现象。陈正华进行枇杷的微茎尖（1mm以下）培养时因酚类物质褐化死亡；在进行较大的茎尖培养时褐化现象会消失。Wang等报道，富士苹果和金华桃在9月到2月取材褐变轻，5月到8月取材褐变重。可见，外植体的选择对组织培养的成败至关重要。 2.3 组织培养中外植体的褐化 过高的无机盐浓度会引起植物外植体的褐化，这在油棕和云桑的组织培养中得到了体现。芸苔属植物光照时间过长、光照强度过大都会使褐化现象变得严重，甘蔗胚性细胞在过强的光照（2 500 lx以上）下，细胞团表面容易褐变，弱光下则会出现绿色芽点。高温能促进酚类氧化，而低温可以抑