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不同蛋白沉淀方法对尿液蛋白双向电泳结果的影响 为了对疾病的诊断、治疗和预后进行评估，主要是为了找到新的生物标记分子以确定疾病的治疗效果。然而，溶液中含有大量的阳离子和碱性离子，这干扰了蛋白质组的技术结果。因此，只有在特殊处理后，才能清楚地显示蛋白质的出现。目前, 尚无尿液蛋白质标本制备的统一方法。2009年7~12月, 我们采用3种方法沉淀尿液蛋白, 分析其双向电泳 (2-DE) 图谱, 观察这些方法对尿液蛋白2-DE结果的影响。 1 材料和方法 1.1 有机溶剂缓冲液 丙烯酰胺, 四甲基乙二胺, 丙酮, 三氯乙酸 (TCA) , 三氟乙酸 (TFA) , 二硫苏糖醇 (DTT) , 乙腈 (ACN) , 等电聚焦 (IEF) 缓冲液;固相pH梯度 (IPG) 干胶条, IPGphor电泳仪, Imager Scanner扫描仪, Progenesis Samespots 分析软件。 1.2 尿蛋白沉淀及回收率 ①尿液收集:收集第1次晨尿中段尿20~30 ml, 4 ℃、1 500 g离心15 min, 去除细胞碎片, 置-80 ℃冰箱备检。②尿蛋白沉淀:分别取5 ml尿液, 分别采用丙酮沉淀法、ACN/0.1%TFA沉淀法、20%TCA/丙酮沉淀法沉淀尿液蛋白质, 真空干燥后重悬于IEF缓冲液200 μl中。尿蛋白回收率=沉淀后的尿总蛋白含量/沉淀前的尿总蛋白含量×100%。③2-DE:上述处理过的尿液样本以pH值为4~7的线性IPG干胶条进行2-DE, 染色、扫描, 采用Progenesis Samespots 软件对蛋白点进行分析。 1.3 统计方法 采用SPSS16.0统计软件。数据用单因素方差分析。α=0.05。 2 -de蛋白点分辨率 TCA/丙酮沉淀法所得到的蛋白点数为 (380±11) 个, 显著多于ACN/0.1%TFA沉淀法的 (260±14) 个和丙酮沉淀法的 (226±15) 个 (P均0.05) , 且2-DE图谱背景清晰, 蛋白点分辨率高;后两种方法所得到的蛋白点清晰度欠佳, 2-DE胶上均有较多的水平条纹, ACN/0.1%TFA沉淀法所得到的蛋白点数高于丙酮沉淀法 (P0.05) 。 TCA/丙酮沉淀法的蛋白回收率为67.6%±8.1%、ACN/0.1%TFA沉淀法的蛋白回收率为47.1%±7.0%, 均显著高于丙酮沉淀法的11.8%±2.8% (P均0.01) 。TCA/丙酮沉淀法中, 尿液经-20 ℃TCA沉淀24 h的蛋白回收率为67.6%±8.1%, 高于-20 ℃ TCA沉淀2 h的蛋白回收率 (44.3%±5.6%) 。 3 不同acn沉淀法的对比 在尿液蛋白质组学的研究中, 为了克服尿液低蛋白浓度、高盐浓度和清除一些高丰度蛋白, 常以透析、冻干方法联合沉淀、固态提纯、离心过滤、超速离心等获取蛋白。然而, 随着处理步骤的增加, 常导致额外蛋白丢失, 因此如何优化样本准备过程, 以最小的蛋白损失, 达到蛋白浓缩的目的, 是尿液分析的关键。 本实验中我们发现, ACN/0.1%TFA沉淀法和丙酮沉淀法所得到的尿液蛋白2-DE图谱均有较多水平条纹, 虽然前者2-DE上的蛋白点数多于后者, 但蛋白点的分辨率欠佳, 提示ACN沉淀或丙酮沉淀必须与脱盐/浓缩步骤相结合, 才能得到高质量的2-DE图谱。有学者比较ACN沉淀法与其他尿液蛋白处理方法如乙酸沉淀、丙酮沉淀、硫铵沉淀、氯仿沉淀、乙醇和甲醇沉淀、离心过滤、冻干和超速离心等发现, ACN沉淀法尽管产生了最高的蛋白点数 (206点) , 但是蛋白回收率最低 (20%) 。Khan等发现, ACN沉淀法必须与膜过滤脱盐相结合, 才能得到高蛋白点数和高分辨率的尿液蛋白2-DE图像。 TCA能消除干扰IEF的盐和其他分子, 降低导电能力。本实验结果发现, 尿液样本经20%TCA沉淀后所得到的蛋白回收率和蛋白点数均高于ACN/0.1%TFA沉淀法和丙酮沉淀法;而且在-20 ℃ TCA中沉淀24 h所得到的蛋白回收率高于-20 ℃ TCA沉淀2 h者, 说明延长沉淀时间可能有利于蛋白沉淀。总之, 20%TCA/丙酮沉淀法能同时脱盐和浓缩尿液;尿液样本在2-DE前不再需要经过额外分离、脱盐、冷冻干燥和其他前加工过程, 即能获得高蛋白回收率、高分辨率的2-DE图谱。