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基于微阵列dna芯片技术的抗真菌药物研究 微阵列dna芯片技术可以同时检测成千上万的基因的发现，并应用于药物开发。随着大规模基因搜索的推进，40个生物组完成了搜索工作。因此，这些信息可以用于构建适合生物的微矩阵dna芯片，以了解细胞生命代谢、植物生化因素的差异。对于微矩阵dna芯片研究所产生的大量数据，我们需要结合统计和数学方法来探索其背后的神秘关系。系统分组法是研究微矩阵dna芯片数据的许多方法中应用最广泛的方法。根据微矩阵dna芯片中的每个基因进行独立处理，计算每个类别之间的距离，根据多个芯片产生的实验数据计算每个类别之间的距离，以将最后两个类别合并，并使用一个新类别的值替换相同的值。在制备全细胞肺癌微矩阵dna芯片的基础上，我们使用9个具有抗真菌活性的药物处理各自的基因表，并对它们进行聚类分析。结果表明，具有类似于规则序列的基因的表达方向相似，因此也可以通过这些已知功能基因来推断未知基因的功能。c.不同化合物处理祖母细胞后，化合物的聚类分析也可以了解它们的功能机制是否相似。 1 材料和方法 1.1 药物、药品与培养基 两性霉素B(amphotericin B)、制霉菌素(nystatin)、盐酸小檗碱(berberine chloride)、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)、克霉唑(clotrimazole)、澳洲茄胺(slasodine)购自Sigma公司,酮康唑(ketoconazole)购自ICN Biomedicals Inc.,大蒜新素(allitridi)购自上海禾丰制药有限公司,土槿皮酸B(psudolaric acid B)由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室提取获得.除大蒜新素外,其余药品都溶于二甲基亚砜(DMSO)中. 培养酵母菌的YPD培养基成分:1%酵母提取粉,2%蛋白胨及2%葡萄糖,pH=6.0±0.2,108℃灭菌20 min. 接受药物处理的L1190酿酒酵母菌株为双倍体菌株. 1.2 荧光交换实验 酵母微阵列DNA芯片的构建,酵母菌RNA的抽提,反转录标记cDNA,杂交以及数据处理方法与我们以前的报道相同.利用DNA芯片上的内标系统对分析数据进行归一化.同时为了消除荧光素cy3和cy5在标记cDNA和扫描过程中的差异,化合物处理和对照的酵母细胞RNA样在反转录过程中进行荧光交换实验,即cy3标记处理细胞的RNA,cy5标记对照细胞的RNA样为一组;cy5标记处理细胞的RNA,cy3标记对照细胞的RNA样为荧光交换的一组,基因变化的数值取两组数据的平均值.而对于每个化合物处理,都作两次独立性的实验,分析两次实验中表达变化趋势一样的基因.这样一个化合物处理需要4张DNA芯片来得到基因表达谱数据. 1.3 dmso前处理 各化合物对酿酒酵母菌株L1190的最小抑制浓度(MIC值)测定方法参照文献.酵母菌在YPD液体培养基中30℃培养至对数早期(A600≈0.8),分成若干等份,加入各化合物至其MIC值的1/2浓度.具体的终浓度是:两性霉素B和制霉菌素为2.5 mg/L、盐酸小檗碱100 mg/L、5-氟胞嘧啶25 mg/L、酮康唑和澳洲茄胺为50 mg/L、克霉唑2.5 mg/L,土槿皮酸B 6.0 mg/L、大蒜新素9.0 mg/L.大蒜新素的对照样加等量体积的水,其余样品的对照加入等体积的DMSO,加入DMSO的体积小于培养基总体积的0.1%,以避免由DMSO带来的对基因表达的影响. 继续培养90 min(酵母细胞的倍增殖时间),测定处理的及对照样品的A600值.化合物处理样品的生长率是对照菌的65%～85%. 5 000 r/min离心回收细胞,于液氮中速冻,转移至-85℃冰箱保存抽提RNA备用. 1.4 可视化软件好 系统聚类分析软件Cluster及其分析结果可视化软件TreeView都从Stanford大学下载(/clustering). 2 酵母细胞后的基因表达谱分析 利用酵母基因组规模的微阵列DNA芯片,可以高通量地研究酵母细胞在基因表达水平上对不同化合物的反应.对所获得的全基因表达谱分析表明,作用机理不同的化合物处理后,细胞的基因表达变化差异很大,例如两性霉素B处理后有1 455个基因的表达变化在2倍以上,酮康唑处理有253个基因的表达变化在2倍以上,而土槿皮酸B处理只有24个基因的表达变化在2倍以上.本研究所用化合物的抗真菌作用机理列于表1中.单独分析每种药物作用后获得的基因表达谱(图1),可以获得相应的与化合物作用机制相关的信息.例如分析已知作用靶点在细胞膜上的抗真菌药物(两性霉素B,制霉菌素)所对应的基因表达谱可以发现,与膜上营养物质吸收有关的协助运输蛋白的编码基因受到诱导,这样细胞可以缓解药物所造成的伤害.而通过聚类方法分析多个化合物的基因表达谱,