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川楝子与肝脏cyp3a活性的相关性研究 梓子是毛囊科植物的后代。川楝子首载于《神农本草经》。性味辛、甘、热,有毒。具有回阳补火,温中止痛、散寒除湿之功,被誉为“回阳救逆第一品药”。其主要功效为补火助阳,鼓动阳气以恢复脏腑气机的升降出入、气血津液的运行敷布、经络气血的流通灌注,从而维持人体正常生理的活动。由于川楝子毒性极强,误食或用药不慎则可发生中毒。 人类进行药物代谢的主要器官是肝脏。肝脏进行生物转化则依赖于微粒体中的多种酶系,其中最重要的是细胞色素P450(CYP)混合功能氧化酶系统。由于该酶系广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官,因此由P450酶系催化的氧化还原反应可发生在体内许多部位。CYP参与90%以上药物的代谢。其中,肝脏的CYP酶活性对口服药物的代谢具有重要的意义。P4503A(CYP3A)是CYP酶系最主要的亚型之一。CYP3A占肝脏CYP总量的30%、占肠组织CYP总量的70%,参与50%以上口服药物的I相代谢。目前研究发现,大部分口服中药可诱导或抑制CYP3A活性、蛋白及基因水平,从而影响其自身代谢并容易引起药物间相互作用[2~6]。本实验就观察川楝子与CYP3A相关性,了解川楝子体内代谢是否与CYP3A相关,为川楝子的临床安全应用提供参考。 1 材料和方法 1.1 动物中心模型 ICR小鼠,雄性,体重(26±2)g,60只,购自北京维通利华实验动物中心,动傲物合格证号SCXK(京)2002~2003,在本室饲养3天后用于正式实验。 2 试验试剂和试剂 川楝子水提物:由北京中医药大学中药学院中药化学教研室提供;酮康唑片(CYP3A的抑制剂酮康唑为阳性对照药):由昆明云健制药有限公司提供;磷酸二氢钠(批号、磷酸氢二钠(批号、氯化钠(批号、DAB(批号、聚乙二醇6000(批号、考马斯亮蓝(批号均由北京化学试剂公司提供。红霉素(批号、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)生成系统(包括4mmol/L NADP,10mmol/L 6-磷酸葡萄糖二钠,6-磷酸葡萄糖脱氢酶(XV,Sigma)4U/ml)、甲醛(批号、醋酸(批号、乙酸胺(批号。 3 光光度计 SHIMADZU UV-120-02紫外可见分光光度计;德国JOUAN恒温高速离心机;北京医疗设备厂恒温水浴箱;SHI-MADZU Bl-220H电子天秤;江西医疗器械厂液体快速混匀器。 4 实验方法 4.1 动物组 雄性ICR小鼠,按体重随机分为正常对照组、正常加川楝子大、小剂量组,酮康唑组,每组15只。 4.2 灌胃酮康唑组 川楝子两个剂量组均灌胃相应剂量的川楝子煎煮液(0.2ml/10g),酮康唑组灌胃酮康唑溶液(150mg/kg,0.2ml/10g),正常对照组灌胃等容量的生理盐水。每天一次,连续14次。 4.3 测试指标 第14天动物禁食过夜,断头处死。迅速打开腹腔,取部分肝脏和小肠(近胃幽门处约20cm)组织制备微粒体检测肝脏CYP3A活性。 4.3.1 磷酸缓冲液和匀浆器匀浆 取肝脏和小肠组织,用预冷0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗后,用滤纸吸水分,称重,1∶4比例加0.1mol/L磷酸缓冲液,用电匀浆器匀浆。在高速离心机上离心(9000r/min)15min后,取上清液加入终体积为8.5%的50%聚乙二醇溶液,10000r/min离心20min,沉淀部分用50%聚乙二醇溶液,10000r/min离心20min,弃去上清液,所得微粒体悬浮与含有30%甘油的0.1mol/L磷酸缓冲液中,分装后-80℃保存。整个过程要在1~4℃低温中进行。 4.3.2 测定蛋白质含量 4.3.3 红树莓原汁混施 参照有关文献,用红霉素脱甲基活性测定法进行活性测定。取相当于0.4mg微粒体蛋白的肝微粒体匀浆分别加入不同试管中,在每只试管中加入4mmol/L的NADPH0.05mL,0.01mol/L的磷酸缓冲液0.25ml,然后用蒸馏水定容至0.5ml;各试管中红霉素的浓度都是0.4mmol/L。37℃温孵20min,然后加入25%硫酸锌溶液0.05ml,混匀。终止反应后,离心,上清液中加入Nash试剂,50℃温孵30min后,测溶液在420nm处的吸光度,计算CYP3A比活性。 4.4 统计方法 实验数据以均数±标准差表示,用SAS 8.2处理。 5 肝脏cyp3a活性 与正常对照组相比,酮康唑组和川楝子大、小剂量组肝脏、小肠CYP3A活性降低,差异显著(P0.05);与酮康唑组相比,川楝子大、小剂量组肝脏、小肠CYP3A活性无显著差异(P0.05)。结果