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炮制时间对制乌头中5种化学成分的影响 何首乌最初出现在开宝草本植物中。这是蓼科植物的干燥部位。它可以解毒、消除邪气、润肠排便。产品具有补肝、肾、精血、乌须发等功效。《中国药典》和《全国中药炮制规范》对何首乌炮制时间未做明确规定,课题组采用大鼠血虚动物模型,证明采用传统方法炮制24,32,40 h的炮制品醇提液显示一定的补血功效,生首乌和72 h炮制品醇提液则未显示出补血功效。 何首乌主要含2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)、游离蒽醌(如大黄素与大黄素甲醚)等,是目前何首乌质量控制的主要成分,在2010年版《中国药典》中均有含量测定要求。此外,近几年研究发现,何首乌经炮制后可检测到没食子酸、5-羟甲基糠醛(5-HMF)等成分,但是否与其炮制后药效变化相关尚不明确,目前仍缺乏制何首乌饮片有效的质量控制方法。 本文采用RP-HPLC法建立制何首乌中没食子酸、5-羟甲基糠(5-HMF)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素与大黄素甲醚的含量测定方法,分析生首乌及其24,32,40,72 h的炮制品5种成分的含量变化规律,结合前期药效研究结果,为进一步研究制何首乌饮片质量控制方法提供参考。 1 材料表面 1.1 高效液相色谱检测 美国Agilent 1200型高效液相色谱仪(含在线真空脱气机,高压四元泵,自动进样器,智能化柱温箱,二极管阵列检测器DAD,Agilent1200series色谱工作站;BS224 S电子分析天平(Sartorius);USC-702超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司);G20型医用高速离心机(安新县白洋离心机厂);minipore纯水机 1.2 药品、试剂与仪器 没食子酸对照品(批号110831-200302)、5-HMF标准品(批号111626-200402)、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号110844-200505)、大黄素对照品(批号0756-9707)与大黄素甲醚对照品(批号110758-200509)均购自中国药品生物制品检定所;其余所用试剂均为色谱纯,水为超纯水。 何首乌饮片生品(批号050402)由广东省康美饮片厂提供,产地为广东德庆,原药材经该厂质检部鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的块根。制首乌饮片由本实验室人员在康美饮片厂炮制,采用传统炮制方法,将润透后的生药置笼屉蒸,分别蒸制24,32,40,72 h,低温烘干。 2 方法和结果 2.1 检测波长和方法 色谱柱为Phenomenex KinetexTMC18(4.6 mm×100 mm,2.6μm);流动相A为乙腈,B为0.5%乙酸,梯度洗脱(0~7 min,2%~3%A,98%~97%B;7~18 min,3%~28%A,97%~72%B;18~24 min,28%~55%A,72%~45%B;24~36min,55%~95%A,45%~5%B);流速1.8 m L·min-1,柱温30℃,DAD全波长扫描范围为190~400 nm,检测波长没食子酸270 nm、5-HMF 284 nm、二苯乙烯苷320 nm、大黄素和大黄素甲醚254 nm;进样量5μL。对照品与供试品色谱图分别见图1,2。 2.2 对照品溶液的配制 分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷与大黄素对照品适量,置于100m L量瓶中,加80%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别配制成117.0,107.0,107.0,123.0 mg·L-1对照品溶液;精密称取大黄素甲醚对照品适量,置于100m L量瓶中,加80%甲醇适量,超声10 min,超声后冷却至室温,80%甲醇补足至刻度,摇匀,精密移取2.87 m L置于10 m L量瓶中,加80%甲醇溶解并稀释至刻度,配制成33.84 mg·L-1大黄素甲醚对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备 取制何首乌细粉约0.25 g,精密称定,置于100 m L量瓶中,加入80%甲醇适量,静置30 min后,超声提取20 min,超声后冷却至室温,80%甲醇补足至刻度,摇匀,10 000 r·min-1离心3min,吸取上清液,0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液为供试品溶液。 2.4 高效液相色谱法 精密移取5种对照品溶液,分别用80%甲醇配制成6个不同质量浓度,见表1,按2.1项下色谱条件,分别取系列质量浓度的没食子酸、5-HMF、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品溶液注入高效液相色谱仪,测定峰面积值;由于所考察的对照品溶液线性范围较广,采取以对照品溶液浓度(mg·L-1)为自变量(X),色谱峰面积为因变量(Y),利用Excel数据处理软件进行最小二乘法回归分析,得到