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用于种间杂交遗传的罗汉果遗传多样性分析 动脉c.弗里奥尔是温柔的马蹄莲科的一种植物。它的果实是传统中药,用于治疗支气管炎、急慢性咽喉炎、哮喘和感冒等。罗汉果中所含甜度极高的甜味物质是一种低卡路里的理想天然甜味剂(李典鹏等,2000),对肥胖症、糖尿病患者是理想的糖替代品。广西北部的永福县、临桂县是传统的罗汉果产地,是栽培罗汉果的起源地(周良才等,1981),罗汉果是当地的经济支柱之一。近年来广西北部的融安县、融水县、龙胜县和灵川县的种植面积在逐步扩大,广东北部和贵州南部也有少量种植。 ISSR(inter-simple sequence repeat)是一种新型的分子标记(Zietkiewicz等,1994),具有很高的稳定性和多态性(Tsumuray等,1996;Fang等,1997),已成功应用于某些重要经济植物的遗传多样性研究(Blair等,1999;钱韦等,2000;Martins等,2003;马朝芝等,2003)。对罗汉果的研究主要集中在化学成分、甜味素提取、栽培技术和病毒防治等方面(李典鹏等,2000;斯建勇等,1996;余丽娟等,2003;杭玲等,2003;蔡健和等,2001),而缺乏在遗传多样性方面的研究报道。我们应用ISSR分子标记对75份栽培罗汉果样品进行了分析,目的在于研究栽培罗汉果的遗传多样性,为栽培罗汉果种质资源的保护和利用提供科学的依据。 1 材料和方法 1.1 样品采集和处理 实验材料采自广西永福县龙江乡、临桂县茶洞乡和融安县雅瑶乡。在每一栽培农户处取样避免品种重复(即每个品种只取一份样品),相同的采集地点同一品种的取样不超过3份。采集到的植株叶片,插入水中带回实验室,存放于-70℃超低温冰箱中备用。总共采集到75份样品:雌株样品62份,其中61份分属青皮果(Q)、红毛果(H)、爆棚籽(B)、茶山果(C)、冬瓜汉(D)、马铃果(M)、长滩果(T)、拉江籽(La)8个品种,另有1份样品系不确定,以当地习惯花皮籽(Ha)命名;雄株(Y)样品13份。各样品的编号和采集地见表1。 1.2 pcr扩增条件及程序 采用CTAB法(Doyle等,1987)提取罗汉果叶总DNA。 实验所用ISSR引物均由上海生工公司合成,引物序列参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第九套ISSR引物序列。从69个引物中选出13个扩增条带清晰、多态性带明显、背景清晰、反应稳定的引物用于全部75份DNA样品的扩增,各ISSR引物名称及序列见表2。 ISSR扩增反应条件经过比较和优化确定为25 μL的PCR反应液内含:约30～50 ng模板DNA,1U Taq酶,1×PCR缓冲液,2.0 mmol/L MgCl2,4种dNTPs各0.2 mmol/L,0.5 μmol/L引物。PCR扩增程序为94 ℃预变性3 min,接着进行40个循环:94 ℃变性1 min,52 ℃退火50 s,72 ℃延伸2 min,循环结束后72 ℃延伸7 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离,用Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker作为标准分子量对照,溴化乙锭染色,复日FR-980凝胶成像仪上观察照相、记录。 1.3 电泳谱带记录 ISSR是显性标记,同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性,按照相同迁移位置上有扩增带记为1、无带记为0的方法记录电泳谱带,仅清晰、可重复的并且长度在400～2 000 bp范围内的扩增带才被记录。用NTSYS-pc version2.02软件(Rohlf,1998)计算了Nei等(1979)相似性系数,通过该软件的Eigen程序分别对雌株和雄株做主成分分析(PCA),并进行单株的UPGMA聚类分析。 2 结果与分析 2.1 多态性引物扩增效果 用13个ISSR引物对75份样品的总DNA进行扩增,所有扩增反应均重复两次,两次PCR扩增产物重复性好且稳定,扩增得到的条带数及多态性带数见表2。总共记录到了88条扩增带(平均每个引物6.7条),其中64条是多态性的,多态条带比率(PPB)为72.73%。引物UBC811得到的条带数最少,为3条;引物UBC840得到的条带数最多,为10条。其中引物UBC866扩增得到的带型见图版Ⅰ。 2.2 品种间的遗传分化 根据得到的0,1矩阵,计算样品间的Nei和Li相似性系数。品种及雄株的平均相似性系数见表3。结果表明青皮果、红毛果、爆棚籽的样品间相似性系数很高,平均值分别为0.958、0.952和0.988。这三个品种的品种内存在多个样品间没有遗传差异的情况:青皮果Q3等5个样品之间、Q8等4个样品之间、Q1与Q16及Q11与Q15之间,红毛果H3等12个样品之间以及爆棚籽B2等4个样品之间的相似性系数为1.0,即无遗传差异。茶山果、冬瓜汉及雄株