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甘薯茎尖组织培养研究 重庆是中国的主要甘薯产区之一。它的种植面积和产量分别为中国的三倍和四级。甘薯已成为当地农业的主要产业。甘薯由于受病毒侵染导致种性退化, 使优良品种的育种特性无法得到全部展现, 直接影响到单产和品质, 严重阻碍了良种推广和大面积生产。目前, 采用茎尖脱毒是恢复品种育种特性, 防止或减少因病毒感染造成损失的最有效途径。本文通过对当前重庆市主推的高淀粉专用品种‘渝薯2号’进行茎尖脱毒培养效果的研究, 进一步探讨高淀粉品种茎尖组织培养的方法, 以期能够提高品种脱毒率和成苗率。 1 材料和方法 1.1 材料表面 试验选用高淀粉品种‘渝薯2号’作为供试材料。 1.2 方法 1.2.1 不同方法消毒微茎尖培养 大田选取生长势强的健康植株, 剪取3 cm左右长的顶芽, 将其用0.1%洗衣粉液浸泡10 min, 流水冲洗1~2 h后, 采用不同方法消毒: (1) 用2.5%Na OCl水溶液或0.1%生汞一次浸泡消毒; (2) 先用75%酒精浸泡60 s, 再用2.5%Na OCl或0.1%升汞消毒5~10 min。之后用无菌水冲洗5次, 切取合适的微茎尖, 置于添加筛选的培养基上培养。5 d后统计污染数;培养70 d, 统计死亡数、成苗数。计算污染率、死亡率、成苗率, 筛选最佳消毒方法。 1.2.2 因素4个不同的处理 使用正交设计的方法筛选最优不同浓度生长调节剂配比。取3个因素:BA、NAA、GA3, 每个因素设3个水平 (BA 0.5、1.0、2.0 mg/L, NAA 0.05、0.1、0.2 mg/L, GA30.05、0.50、1.00 mg/L) , 共9个处理。培养70 d观察成苗率及芽的生长表现。 1.2.3 叶原基、茎尖在培养方基中的筛选 取渝薯2号带病毒植株的芽, 消毒后剥离带1个叶原基 (0.1~0.2 mm) 、带2个叶原基 (0.3~0.4 mm) 、带3个叶原基 (0.6~0.7 mm) 的茎尖接种于筛选的培养基上培养70 d, 统计脱毒率、成苗率、单茎尖芽数。 1.2.4 培养二次培养基 采用一次培养及二次培养2种培养方式。一次培养即始终在筛选的生长调节剂培养基上培养;二次培养即在生长调节剂培养基上培养30 d左右, 待茎尖分生组织膨大变绿后, 转到1/2 MS无生长调节剂的固体培养基上培养。培养70 d后统计成苗率、单茎尖芽数、平均株高。 1.2.5 添加蔗糖、琼脂粉 培养基配制:不同培养基按试验要求添加生长调节剂或其他成分;每升MS培养基中加入30 g蔗糖、8 g琼脂粉, p H=5.8。 培养条件:T= (28±2) ℃;光照时间16 h/d;光照强度2000~3000 lx。 2 结果与分析 2.1 不同方法使用一步法,污染率高,死亡率低,成苗率高。c组 不同消毒方法条件下, 茎尖的污染率、死亡率和成苗率有明显的差异。A组使用两步法, 污染率最低, 但死亡率却显著上升;B组使用一步法, 污染率较低, 死亡率最低, 成苗率超过76%;C组也使用一步法, 但污染率最高, 说明Na OCl的消毒效果次于升汞。试验结果表明, 处理5 (0.1%升汞的溶液消毒7~8 min) 的污染率、死亡率低, 成苗率达到85% (见表1) 。 2.2 渝薯2号茎尖分生组织的培养顺序 根据正交设计法, 某因子不同水平的极差越大, 说明该因子对试验指标的影响越大。从正交试验的结果 (表2) 可以看出, 3个因子对渝薯2号茎尖分生组织培养的影响顺序由大到小为NAAGA3BA。根据某因素kj值大小确定该因子的最好水平, 可知BA最好水平为1.0 mg/L、NAA最好水平为0.05 mg/L、GA3最好水平为0.5 mg/L。 2.3 再生植株的培养 在筛选的培养基上, 由不同大小茎尖诱导的愈伤组织, 其生长速度、成苗率和脱毒率有明显差异。从表3可以看出, 带1个、2个、3个叶原基的茎尖的成苗率分别为55.3%、75.8%、81.5%, 可见随着外植体所带叶原基数目的增多, 培养出再生植株就越容易。在培养过程中, 带1个叶原基的茎尖表现出愈伤组织形成慢、根和叶分化慢、单茎尖芽数少 (1.2个) , 比带2个、3个叶原基的茎尖少0.6和0.9个。带3个叶原基的茎尖成苗率较高, 但脱毒率显著下降, 只有35.5%, 显然, 茎尖越大, 脱毒效果越差。试验结果表明, 大小0.3~0.4 mm、带2个叶原基的茎尖, 在成苗率、脱毒率和单茎尖芽数3个方面综合表现最好。 2.4 次培养与自然株高、成苗率、单茎尖芽数的变化 不同的培养方式对茎尖分生组织培养的影响有差异。采用一次培养平均株高与二次培养相比差异不大, 但成苗率高15.7个百分点, 单茎尖芽数增加0.2个 (表4) 。在茎尖分生组织培养中, 成苗率是关键因素, 因此