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甘薯茎尖培养脱毒技术研究 甘薯病毒是世界上常见的疾病，发生在中国的主要甘薯产区。罹病甘薯的产量和品质均有不同程度下降,造成所谓“种性退化”。经在山东省调查,某些品种的苗床病株率已达90%以上,田间病株率也在60%～70%。国外早在本世纪50年代末就开始进行甘薯病毒调查鉴定工作,目前报道的甘薯病毒及其类似病害有10余种。Nielsen(1960)首次报道用分生组织培养消除甘薯病毒。我国于50年代曾报道过甘薯病毒病的发生,但未能深入研究,直到90年代才鉴定出我国甘薯主栽区病毒种类为甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯潜隐病毒(SPLV),并在山东省发现自然侵染甘薯的烟草花叶病毒(TMV)。目前对感染病毒的甘薯尚无有效治疗方法。1991～1996年作者对甘薯茎尖培养方法、脱毒效果、组培苗病毒检测技术等进行了研究,结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 紫环斑、羽状驳岸苗的收获 以山东省12个主栽甘薯品种为试材,将田间表现紫环斑、羽状斑驳、紫斑等症状病苗的薯块收获,藏窖2个月后,置28～31℃下育苗2周,苗长至20cm左右时,转入20℃下备用。 1.2 个叶原基的茎尖 取薯苗茎顶部3cm,剪去较大叶片,表面消毒后,在解剖镜下无菌剥离带1～3个叶原基的茎尖。以MS为基本培养基,附加不同浓度的NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、GA3(赤霉酸)和Ad(腺素),pH值为5.8,培养温度29±1℃,光强度1600lx,日光照16h。 1.3 病苗培养 培养基分别含有植物病毒钝化剂1.5%TS有效成分0.15mg/L和0.015mg/L,调pH值前加入。将1.5%TS稀释1000倍,喷洒在病苗叶面,1周后进行茎尖培养。用未经药剂处理的茎尖培养作对照。 1.4 集体培训中毒检测 1.4.1 抗血清、免疫双向扩散 以甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)单克隆抗体和烟草花叶病毒(TMV)抗血清,对无症苗进行斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)、琼脂免疫双向扩散及免疫电镜观察检测,每一样品重复2次。 1.4.2 巴西牵牛叶片发病 用巴西牵牛(Ipomoea setosa)为砧木。检测组培苗或抽检经血清学检测呈阴性反应的样品。将其顶芽部分侧接到具2～3张叶片的巴西牵牛植株上,保留巴西牵牛上部,蔽阴3～4 d,15～40d内观察记载发病情况,检测SPFMV和SPLV。发病株为新生叶出现皱缩、花叶、或黄脉。苋色藜(Chenopoium amaranticolor)用于检测TMV,待测样品加0.02mol/L pH7.2 PBS研磨,用常规摩擦接种,15～20d内观察发病情况,发病株为接种叶出现米粒大小黄斑,继而发展为局部枯斑。 2 结果与分析 2.1 株苯甲胺发芽试苗的培养效果 离体茎尖在含激素培养基上培养15～20d后,转入1/2MS无激素培养基继续培养生根成苗。4个品种的茎尖在11种不同激素配比的培养基上均能成苗,但成苗率和成苗时间有差异,愈伤组织发生情况也不同,其中以培养基内含6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+Ad 5 mg/L效果最好,愈伤组织发生中等,4品种平均发芽率为97.3%,成苗率达76.5%,接种后43～60d便可长成具5～7叶、5cm高的试管苗。不同甘薯品种在此种培养基上的成苗率为:鲁薯3号77.4%、鲁薯6号68.5%、鲁薯7号62.5%、鲁薯8号95.6%、丰收白83.3%、北京553号56.5%、徐薯18号51.2%、86-284号60%和徐25-2号50%。成苗率的差异可能与品种内源激素水平和生长特性有关。 2.2 茎尖培训效果 2.2.1 叶原基对脱毒率的影响 试验用北京553号、86-284号和鲁薯7号3个品种,每处理剥离茎尖24个以上。3个品种试验结果平均值表明,切取的茎尖大小与获得无毒苗的比率呈显著的负相关(r=-0.9875*,Y=50.3-11.2X),当茎尖分生组织带1个叶原基时,脱毒率最高,为38.1%,带3个叶原基时脱毒率较低,为15.7%。切取的茎尖大小与成苗率呈极显著的正相关(r=0.9953**,Y=25.6+13.7X),当茎尖分生组织带1个叶原基时,成苗率较低,为38.6%,带2个叶原基时为54.6%,带3个叶原基时成苗率上升为66.0%。无叶原基茎尖,接种后2d全部死亡。 2.2.2 不同品种间脱毒率差异 在苗床选择生长健壮、无明显病毒病症状的生产用苗进行茎尖离体培养,结果表明,鲁薯3号脱毒率为86.7%,徐薯18号为73.3%,鲁薯7号为84.1%,鲁薯8号为88.6%,丰收白为80%。品种间脱毒率的差异与田间植株感病程度有关,感病程度又受品种种植年限和抗病性影响。如徐薯18种植年限久、面积大、病毒病发生普遍、脱毒率较低。鲁薯7号、8号是近年来推广的新