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毛果鱼藤藤茎hplc指纹图谱研究 毛果鱼藤是豆科植物毛果鱼藤的干燥枝条，也被称为土壤甘草。主要分布在广东、广东等地区。具有润水除湿、止痒、止咳等功效。作为广西壮族民间验方的组成之一, 毛果鱼藤常被用于治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳嗽等症状。中药及其制剂均为多组分复杂体, 且受气候、生态环境等方面的影响, 各化学成分稳定性存在一定的差异, 造成不同批次药材的质量优劣不同, 而中药指纹图谱能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量, 进而对药品质量进行整体描述和评价。目前国内外对毛果鱼藤的质量标准、化学成分、生物活性等方面的研究比较少, 曾有研究者采用薄层色谱和紫外光谱对毛果鱼藤进行鉴别研究, 笔者实验室对毛果鱼藤的化学成分进行了初步的研究, 发现其含有大量有活性的化合物, 对其化学成分的活性追踪试验显示, 不同极性部位具有一定的抑制癌细胞生长的作用。本文应用HPLC方法对不同产地的毛果鱼藤藤茎进行指纹图谱研究, 并针对不同极性部位进行抗癌活性实验, 以期为进一步深入了解毛果鱼藤的化学成分、生物活性及制定毛果鱼藤的质量控制标准提供科学依据, 为壮药毛果鱼藤的进一步开发、利用提供实验依据。 1 测定毛果鱼藤茎robustici结果 SHIMADZU LC-15C高效液相色谱仪;XH-100A微波催化合成/萃取仪 (北京祥鹄科技发展有限公司) ;SHIMADZU Uvmini-1240紫外可见分光光度仪;3111细胞培养箱 (Thermo Fisher Scientific) 。 甲醇、乙腈均为色谱纯 (Fisher公司) , 水为超纯水, 其余试剂均为分析纯。 10批毛果鱼藤藤茎分别于2012~2013年购于广西靖西 (1~6批) 、德宝 (7~10批) , 由广西中医药大学田慧教授鉴定为豆科鱼藤属植物毛果鱼藤 (Derris eriocarpa How) 的干燥藤茎。对照品Robustic acid为本实验制备, 已经核磁共振仪检测为Robustic acid (纯度:96.3%) 。癌细胞株:NCI-H460人肺癌细、SW480人结肠癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、Hela人宫颈癌细胞均由广西医科大学附属肿瘤医院基础免疫室提供。 2 方法和结果 2.1 检测条件及检测波长 色谱柱:Wonda Sil TM-C18(5μm, 4.6 mm×250mm) ;流动相:乙腈 (A) -0.5%醋酸溶液 (B) , 梯度洗脱 (0~20 min, 40%A→60%A;20~30 min, 60%A;30~45 min, 60%A→80%A;45~60 min, 80%A) ;流速:1.0 m L·min-1;检测波长:296 nm;柱温:30℃;进样量:10μL。 2.2 毛果鱼藤茎提取 将毛果鱼藤藤茎粉碎成粗粉 (24目) , 称取粗粉5 g, 加入95%乙醇50 m L, 采用微波萃取仪进行回流提取, 提供功率400 W, 提取温度70℃, 提取2次, 每次20 min, 合并提取液, 离心15 min, 转速3000 r·min-1, 取上清液, 95%乙醇定容至100 m L, 作为HPLC指纹图谱检测的供试品溶液。另称取毛果鱼藤藤茎粗粉50 g, 加入95%乙醇, 提取方法同上, 提取液浓缩, 依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取;分别合并、浓缩萃取液。取上述萃取液浸膏各2 mg, 分别用吐温80助溶 (终浓度小于千分之一) , 分别加1640细胞培养液稀释, 使配成不同浓度的[石油醚部位 (3.35、1.675、0.837、0.419、0.209mg·m L-1) 、氯仿部位 (6.7、3.35、1.675、0.837、0.419 mg·m L-1) 、乙酸乙酯部位 (2、1、0.5、0.25、0.125 mg·m L-1) 、正丁醇部位 (6.7、3.35、1.675、0.837、0.419 mg·m L-1) ]的各供试品溶液。 2.3 对照溶液的制备 精密称取Robustic acid对照品10.0 mg, 置10m L量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液。 2.4 方法研究 2.4.1 仪器精密度试验 取1号药材粗粉5 g (24目) , 按“2.2”项下方法制备供试品溶液, 按照“2.1”项下色谱条件连续进样5次, 记录色谱图, 考察仪器的精密度。结果表明, 色谱峰的相似度在0.996~0.999之间, 各色谱峰相对保留时间的RSD在0.007%~0.027%之间, 各色谱峰相对峰面积的RSD在0.574%~4.351%之间, 表明仪器的精密度较好。 2.4.2 进样测定 取1号药材粗粉5份 (24目) , 每份5 g, 按“2.2”项下方法制备供试品溶液, 按照“2.1”项下色谱条