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炮制对半夏化学成分含量的影响 半夏因其辛辣、麻木而刺入喉咙，对“人呼吸”产生了刺激。自古以来，它就被用作中药的祭品，经过加工后才能使用。《雷公炮炙论》记载:“半夏上有隙涎, 若洗不净, 令人气逆, 肝气怒满”, 半夏洗熟之后, 毒性消失, 可以入药使用。中国药典 (2005版)收录了生半夏、清半夏、姜半夏、法半夏。关于半夏的炮制方法研究已有不少报道, 但对半夏炮制系统的化学成分含量比较还未见有报道, 本研究以总生物碱、鸟嘌呤核苷、可溶性蛋白质、还原糖和总糖为检测指标, 采用紫外, 高效液相等方法对半夏进行含量测定, 以探求炮制对其化学成分的影响。 1 材料和机器 1.1 法半糖方法 依照中国药典半夏炮制方法进行炮制, 得到生半夏、清半夏、姜半夏和法半夏。将制得半夏于60 ℃下烘干至恒重, 粉碎过60目筛, 放置干燥器中备用。 1.2 标准曲线及不标注情况 盐酸麻黄碱对照品 (中国生物制品检定所) 、鸟嘌呤核苷 (Sigma) 、甲醇 (色谱纯, Tedia) 、冰醋酸 (色谱纯) 、溴麝香草酚蓝标准液、浓氨水、三氯甲烷、蒽酮、硫酸、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250等, 未标注均为市售分析纯。 1.3 仪器和检测方法 电子分析天平 (SHIMADZU AUW220) 、SB25-12DT超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) 、旋转式蒸发仪 (上海亚荣) 、紫外可见分光光度计2802H型 (尤尼柯) 、高效液相色谱仪 (waters1525 Binary HPLC Pump;waters 2996 Photodiode Array Detector) , 固定相:YWG C18反相柱 (4.6×150 mm, 5 μm) 。 2 方法和结果 2.1 盐酸麻黄碱溶液的线性关系 利用酸性染料比色法。以盐酸麻黄碱为对照品制得对照品溶液, 将对照液和样品供试液在200~700 nm波长进行光谱扫描, 确定以414 nm波长作为测定波长。以盐酸麻黄碱含量 (μg) 为横坐标, 吸光值为纵坐标, 进行回归, 得回归方程为Y=1.44×10-2X+6.47×10-2,R2=0.999 4, 表明盐酸麻黄碱溶液在0.45~7.5 μg·mL-1之间呈良好的线性关系。精密称取干燥至恒重的通过60目筛的生药粉0.155 0 g, 每个样平行3份, 加浓氨水0.5 mL, 三氯甲烷10 mL, 冷浸12 h后, 冰浴超声提取50 min, 滤过, 残渣以10 mL三氯甲烷分3次 (4, 3, 3 mL) 洗涤, 滤过, 合并滤液, 80 ℃回收三氯甲烷并蒸干, 即得样品。用分液漏斗依次精密加入pH=5.40柠檬酸缓冲溶液5 mL, 水5 mL, 0.05%溴麝香草酚蓝溶液1 mL, 再精密量取三氯甲烷10 mL, 分3次 (4, 3, 3 mL) 将样品转入分液漏斗中, 振摇1 min, 静置1 h后分取三氯甲烷层, 测定吸光度, 根据回归方程, 计算含量。 2.2 测定了鸟酚的含量 2.2.1 色谱柱及流动相 高效液相色谱仪 (waters1525 Binary HPLC Pump;waters 2996 Photodiode Array Detector) ;固定相:色谱柱YWG C18反相柱 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) ;流动相:MeOH~0.01%HAc (5∶95) ;流速:1.000 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:20 μL;波长:254 nm。 2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取鸟苷标准品0.005 0 g, 加水溶解, 定容于25 mL容量瓶中, 得浓度为200 μg·mL-1的鸟苷溶液, 即为对照品溶液。 2.2.3 线性关系的考察 分别精密量取标准品溶液0.1, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5 mL, 置10 mL量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻度, 摇匀, 得到不同浓度的标准品溶液, 分别以上述各标准品溶液进样, 鸟苷标准品的HPLC图如图1, 每个浓度进样2次, 取峰面积的平均值, 以鸟苷含量 (μg) 为横坐标, 峰面积为纵坐标, 进行回归, 得回归方程Y=3.18×106X-3.07×103,R2=0.999 9, 可见鸟苷在2.000~30.00 μg·mL-1范围内线性关系良好。 2.2.4 峰面积及稳定性 制备半夏样品溶液1份, 每隔2 h进样1次, 进样量20 μL, 结果表明, 样品中鸟苷峰面积在10 h内稳定, RSD=1.24% (n=6) 。 2.2.5 精密度测试 取浓度为20 μg·ml-1的标准品溶液进样, 进样量20 μL, 重复测定6次, RSD=0.52% (n=6) 。 2.2.6 建议用在合理的部位处表达0. 精密称取半夏粉末约0.65 g