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甘薯植株再生体系的建立 在甘薯、树枝和大冶附近感染病毒后，植物变小、树枝少、叶片皱纹收缩、生长潜力下降、茎变小、产量和品质显著下降，甚至失去生产和使用价值。利用茎尖分生组织培育脱毒甘薯苗进行栽培应用,是防止甘薯病毒危害、提高甘薯产量和质量最有效的方法。 甘薯脱病毒苗培育技术自20 世纪80 年代引入我国,国内学者对其进行了大量研究,主要针对在甘薯茎尖表面消毒方法、消毒剂种类、消毒剂浓度及处理时间、培养茎尖的大小、培养基的成分、激素的浓度以及甘薯愈伤组织培养的温光条件等方面,开展了一系列的研究工作,取得了很多成果［1 －5］。何新民等以红姑娘2 号甘薯为材料诱导产生愈伤组织和丛芽阶段,以MS + 1. 0 mg/L 6-BA + 0. 01 mg/L NAA + 0. 1 mg / L GA3培养基培养的效果较好; 而1 /2MS +0. 2 mg / L NAA是红姑娘2 号试管苗的适宜生根培养基［6］。湖南是甘薯生产大省,甘薯年种植面积在15 ~ 20 万公顷,以高淀粉含量甘薯生产为主,据不完全统计,全省每年因甘薯病毒病造成的产量损失在30% 以上。因此,笔者对湖南高淀粉甘薯品种脱毒苗培育技术进行研究,以期为高淀粉甘薯品种脱毒苗的进一步开发利用提供依据。 1 甘薯茎尖的消毒处理 1. 1 材料 1. 1. 1 研究对象。供试品种为湘辐1 号和美国SL-9,淀粉含量分别达27% 和25% ,是湖南省目前栽培面积较大、产量及经济性状均表现较好的2 个高淀粉甘薯品种。 1. 1. 2 主要仪器。分析天平,购自德国赛多利斯公司; 超净工作台,购自苏州苏洁净化设备公司; 纯水机,购自深圳市佐泰超声自动化设备有限公司; 高压灭菌锅,购自中远机械有限公司; 光照培养箱,购自常州恒德仪器有限公司; 酸度计,购自梅特勒- 托利多国际股份有限公司; 水浴锅,购自江苏省金坛市环宇科学仪器厂。 1. 1. 3 主要药剂。乙醇、次氯酸钠、琼脂、蔗糖、MS培养基、6-BA、NAA、GA3、氢氧化钠和盐酸等均为国产分析纯,市售。 1. 2 方法 1. 2. 1 种薯的催芽。选择上一年收获的中等大小、无病无伤、皮色鲜亮的甘薯,放入40 ~ 50 ℃ 恒温水浴锅中浸泡10min,浸泡时需翻动种薯,保证种薯受热均匀,然后按品种分类将种薯放置在32. 5 ℃、相对湿度为80% 的光照培养箱内进行催芽培养,当种薯出现了芽尖时将温度调至25 ~ 28 ℃,继续培养。 1. 2. 2 接种前准备。用浓度70% 酒精擦拭培养器皿、解剖刀、剪刀和镊子等接种器具。超净工作台先用浸有浓度70%酒精的脱脂棉擦洗,再经紫外灯照射50 min消毒。组培瓶、培养皿、枪镊等工具均需经高压蒸汽灭菌锅灭菌。 1. 2. 3 外植体处理。甘薯出苗后,剪取生长健壮薯苗茎尖顶端2 ~3 cm,然后用饱和洗衣粉液浸泡消毒30 min,无菌水冲洗4 ~5 次后,采用2 步法表面消毒: 先将甘薯茎尖先用浓度70% 酒精浸泡30 s,再浸入浓度2. 5% 的Na Cl O水溶液消毒5 ~10 min,最后用无菌水冲洗4 ~ 5 次,用无菌纸吸干,在解剖镜下切取0. 4 ~ 0. 5 mm带1 ~ 2 个叶原基的甘薯微茎尖。 1. 2. 4 接种。打开组培瓶塑料盖,用火焰烧瓶口并转动瓶口,将枪镊在火焰上消毒后蘸入无菌水冷却,轻夹起已剪好的微茎尖接种至组培瓶内的培养基上,盖上塑料瓶盖。 1. 2. 5 茎尖培养。将接种好的培养瓶放在人工气候室中,培养室的条件设置为: 温度25 ~ 28 ℃,相对湿度80% ,光照时间14 h/d; 光照强度2 000 ~3 000 lx。 1. 2. 6 病毒检测。脱毒苗的检测首先采取目测法淘汰弱苗和显症苗,再按王庆美改进的NCM-ELISA法进行甘薯组培苗的病毒检测［7］。 1. 2. 7 培养基的配制。甘薯茎尖分生组织的培养常用MS培养基,先配制MS母液,放入冰箱中保存待用,配制培养基时每升MS培养基母液中加入30 g蔗糖,然后用酸度计调整p H为5. 8,按照试验所设计的处理浓度将激素溶解在上述MS母液中,再加7 g琼脂粉,分装于组培瓶中,在121 ~ 126℃ 高压灭菌锅中灭菌20 min,取出冷却备用。 1. 2. 8 培养方式的选择。1不同激素对甘薯茎尖分生组织培养的影响。以MS为基本培养基,然后根据生长激素配比的不同设计成8 个处理。全部8 个处理都添加了细胞分裂素6-苄氨基嘌呤( 6-BA) 和植物生长调节剂萘乙酸( NAA) ,其中编号1、2、5、6 处理6-BA浓度为0. 4 mg/L,其他处理6-BA浓度为0. 8 mg / L,浓度增加1 倍; 编号1、3、5、7 奇数处理NAA浓度为0. 1 mg/L,偶数号2、4、6、8 处理NAA浓度为0.