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瓯柑茎尖分生组织的微芽嫁接脱毒效果研究 茴香是浙江省温州独特的抗贮藏性优良品种，贮藏时间超过250天。然而，由于柑橘黄龙病的破坏，莲花产业的发展非常困难。 欧美各国早在20世纪世纪80年代,就开始系统地研究各类果树的脱毒技术和病毒检测方法,获得了一大批无病毒苗木。20世纪90年代以来,又着重开展了果树良种繁育体系的建立,推行果树无病毒化栽培。20世纪90年代美国柑橘增产五成,一个重要的原因是定植无病毒苗木。 随着国际国内柑橘市场的变化,许多优良地方品种和引进的优良品种需要扩大繁殖,但通常从STG脱毒到提供健康接穗需要1.5～2 a的时间,茎尖微芽嫁接缓苗期长,生长慢的问题制约了新品种的推广和应用。采用茎尖微芽嫁接脱除黄龙病病原已证明是获得无病毒苗木的有效方法,所取茎尖的大小对脱毒效果和嫁接成活率有着明显的影响。针对黄龙病脱毒技术并没有相关的详细资料可寻。 本试验旨在利用PCR分子检测手段,分析确定茎尖微芽嫁接时,脱除柑橘黄龙病所需的最适茎尖大小,从而协调好提高脱毒率与提高嫁接成活率之间的矛盾。同时,为了加快无病毒苗生长速度,满足市场规模化生产的需要,本课题就加速试管苗生长技术进行了研究。 1 材料和方法 1.1 叶片的制备 从浙江省丽水市林业科学研究所提供的2 a生瓯柑苗木上,采得叶片样品,经液氮处理后,贮存在-70 ℃超低温冰箱中。从福建省农业科学院采集接种了经鉴定的黄龙病病原,并表现出黄化斑驳症状的长春花叶片作阳性对照。 1.2 常规消毒处理 冰糖橙(C.sinensisOsbeck )作过渡性砧木。取新鲜种子经去果胶处理后,移到超净工作台上,进行常规消毒处理。去种皮后,将种子接种到MT培养基中,在(26±1) ℃,暗培养2周,获得黄化苗用作嫁接砧木。 1.3 叶原基大小对微芽嫁接 当新梢长至1～2 cm时,采嫩芽作接穗。表面消毒后,在双目实体显微镜下,剥取含有生长锥及1、2、3、4个叶原基的不同大小的茎尖分别进行微芽嫁接,嫁接操作根据文献进行。每种大小的茎尖嫁接60个,分多次进行,嫁接速度为20～25芽/h,每次约需1 h。嫁接成活后,及时除萌,待试管苗长出真叶,叶片长约2 cm 时,将试管苗移入无菌培养土中。待试管苗长出4～6片叶时,取样作黄龙病病原检测。 1.4 pcr扩增试验 根据文献提取脱毒前后样品及对照样品中的DNA,在Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrophotometer上测定DNA浓度,并将其浓度稀释为500 ng/μL,待PCR检测用。根据VILLECHAMOUX等的报道,设计黄龙病亚州株系特异性引物,用于PCR试验。引物由上海生工生物技术公司合成,引物序列为:①(+) 5′-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3′;②(-) 5′-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3′。PCR扩增反应在PTC-100 Peltier Thermal Cycler(MJ Research)热循环仪中进行。采用TaKaRa PCR Kit进行PCR反应,参考说明书中基本操作进行试验。经试验采用的最佳扩增条件为: 94 ℃开始变性5 min,接着,94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,进行33个循环,72 ℃再延伸7 min。 PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶(Mersco),在70 V电压下电泳50 min,溴乙淀染色,然后在凝胶成像系统中观察。 1.5 试苗的制作 准备生长健壮的枳橙砧木,砧木离地10 cm处干茎约为0.8～1.2 cm为宜。在离地面10～20 cm处剪去上部枝梢,在垂直方向切一长度为1.5 cm的切口。当试管苗移栽成活,生长2个月时,用锋利的手术刀将试管苗砧木处削成契形,切面长约1.5 cm,将试管苗靠一边形成层对齐,用塑料带梆紧,用塑料袋将嫁接口以上部分套袋,保湿。以上操作在气温为25～30 ℃条件下进行。 2 结果与分析 2.1 嫁接成活率对茎尖叶原基的影响 利用带有明显黄化斑驳症状的母本植株进行茎尖嫁接试验,结果表明:茎尖大小对茎尖微芽嫁接的成活率有明显的影响。当茎尖含1个叶原基时,成活率最低,为11.1%,当茎尖含2个叶原基时,成活率为47.7%,茎尖含3个和4个叶原基时,嫁接成活率分别为62.2%和78.8%(表1)。观察发现,嫁接后1周,很容易判断砧穗是否愈合,如果没有成活,茎尖会变成褐色或枯萎的点状物,应立刻去除。如果不去除,因伤口刺激嫁接口很容易产生萌蘖,当苗继续生长时,难以辨别是真正的接穗愈合还是萌蘖产生。有少数情况是茎尖既不枯萎也不继续生长,这种类型的试管苗到3～4周时,芽如果还不能迅速抽出,就没有利用价值。据观察,嫁接成活1～2周时,茎尖叶原基的多少与试管苗的叶子数是相符合的(图1)。当生