柴胡皂苷a对难治性癫痫大鼠多药耐药蛋白p-糖蛋白表达的影响.docxVIP

柴胡皂苷a对难治性癫痫大鼠多药耐药蛋白p-糖蛋白表达的影响 癫痫是神经系统中常见的疾病。中国有600.700万患者，其中30%的患者出现癫痫发作，由于抗癫痫药物的抗癫痫药物或其他原因，通道转换变得困难。由于难治性癫痫发作频繁,严重影响患者的学习、工作和生活,甚至严重致残,因此研究难治性癫痫发病机制及寻找有效的治疗方法十分必要。柴胡为临床常用中药之一,具有镇静、止痛、降温、镇咳、抗炎抗菌、保肝利胆、降血压、抗病毒、抗肿瘤等作用,柴胡皂苷a(saikosaponin a,SSa)为柴胡主要药理成分柴胡皂苷的一种单体成分,研究发现柴胡皂苷a具有抑制戊四氮致痫大鼠痫性发作的作用。此实验建立了氯化锂-匹鲁卡品难治性癫痫模型,以进一步探讨SSa的抗癫痫作用机制。 1 材料表面 1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠,体重180~220 g,由南方医科大学实验动物中心提供,动物许可证号SCXK(粤)2006-0015。 1.2 托品注射液、丙戊酸钠合成制剂 氯化锂(美国,Sigma公司,批号115K1308),盐酸匹鲁卡品(美国,Sigma公司,批号066k1730),硫酸阿托品注射液(郑州羚锐制药有限公司,批号0905052),丙戊酸钠片剂(VPA,杭州赛诺菲圣德拉保民生制药有限公司,批号0402049)。SSa(上海医药工业研究院),小鼠抗大鼠P-糖蛋白单克隆抗体(C219,Abcam公司,货号ab3364),羊抗小鼠IgG-HRP(武汉博士德生物工程有限公司)。柯达2000MM全光谱多功能活体成像系统(美国,Kodak公司)。 2 方法 2.1 癫痫持续时间用药实验大鼠癫痫性发作行为 参照Turski WA和王本国等人的方法,小剂量反复ip匹鲁卡品制备难治性癫痫大鼠模型。SD大鼠首先ip氯化锂(127 mg·kg-1),18~24 h后ip阿托品1 mg·kg-1,30 min后ip匹鲁卡品(10 mg·kg-1)。如未出现癫痫持续状态(status epilepticus,SE),则每隔30 min继续ip匹鲁卡品(10 mg·kg-1),直至大鼠出现癫痫持续状态后停止注射,空白对照组(A)大鼠ip等体积的生理盐水。大鼠癫痫持续状态发作持续60 min时,以10%的水合氯醛(300 mg·kg-1)ip终止发作。痫性发作行为观察,参照Racine标准,0级:无发作反应;Ⅰ级:节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛;Ⅱ级:点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛;Ⅲ级:出现前肢阵挛但不伴随直立;Ⅳ级:前肢阵挛伴随直立;Ⅴ级:全身强直阵挛发作而跌倒。Ⅳ级以上发作为成功的癫痫持续状态模型,未达到Ⅳ~Ⅴ级发作的弃用。 2.2 癫痫发作监测 癫痫状态后的大鼠经过急性期24 h后,进入10~15 d左右的潜伏期,腹腔注射5%糖盐水5 mL,2次/d。15 d后进入4周慢性期,进行发作行为监测。按照以上标准,Ⅳ级以上发作为成功的癫痫自发发作模型。将成功的癫痫自发发作模型大鼠随机分为5组,模型组(B)、丙戊酸钠(VPA)组(C)、SSa低剂量组(D)、SSa中剂量组(E)、SSa高剂量组(F)。 2.3 给药时间 A组和B组均等容积生理盐水ig给药,C组丙戊酸钠200 mg·kg-1ig给药,D~F组ip SSa 0.54,1.09,2.18 mg·kg-1,各组均连续给药8周。 2.4 一般观察 2.5 抗kt-lt-hrp的制备 治疗结束时,每组随机取3只大鼠,迅速麻醉后断头取脑,冰上分离海马、颞叶皮层,放入-80℃低温冰箱保存。蛋白裂解后,BCA法定量,制备SDS凝胶,加样电泳,待溴酚蓝电泳至分离底部时结束电泳。采用湿转法转膜,先将PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉TBST封闭液中,置于水平摇床上,室温封闭1 h后用TBST清洗3次,每次5 min。用TBST配制一抗(小鼠抗大鼠P糖蛋白1∶25),将PVDF膜放入已配好的抗体稀释液中,4℃过夜,TBST清洗3次,每次10 min。然后放入TBST配制HRP标记的二抗,(羊抗小鼠IgG 1∶2 000),室温1 h。二抗孵育完后,TBST洗膜3次,每次10 min。吸干多余的TBST,用BeyoECL plus发光液显影(A液与B液1∶1配制),Kodak Image Station 2000MM成像系统采集图像,用图像处理软件Image Tool 3.0分析各蛋白带的灰度值,用P-gp/β-actin代表蛋白条带的灰度比值。 2.6 统计学分析 数据用SPSS 13.0软件进行统计学分析,计量资料用表示。不同用药组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法。P0.05有统计学意义。 3 结果 3.1 大鼠癫痫性发作情况 在实验过程中,共对70只大鼠腹腔注射匹罗卡品制备难治性癫痫模型。其中5只大鼠反复给予匹罗