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海人酸在大鼠海马腹后致癫痫的实验研究 癫痫是神经系统的一种常见慢性疾病，约1.4是药物难治性癫痫，其中70%是肥叶癫痫。TLE临床研究较困难,建立具有TLE特点的动物模型是有效途径。海人酸(KA)结构类似谷氨酸,与突触后膜的受体结合,产生兴奋性突触后电流,致动物癫痫发作,即海人酸癫痫模型。 材料和方法 1. 试剂和机器 KA,Sigma公司,实验量0.8 μg/0.2 μl;立体定向仪;微量注射器 1 μl;Nicolet公司动态脑电图(EEG)仪。 2. 分组及研究方法 雄性Wistar大鼠,280~320 g,中国军事科学院环境研究所提供。随机分组,每组6只:(1)阴性对照组(N):观察5个月后取脑;(2)急性期组(A):7 d;(3)静止期组:S1,14 d;S2,28 d;(4)慢性期组(C):5~6个月。 3. 立体定向注射组 大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉,于立体定向架上,手术暴露颅骨,立体定向引导于右侧海马腹后部(A 5.6 mm,L 4.5 mm,V 7.0 mm)20 min匀速注射KA。 4. 症状监测 每天1∶00 PM~6∶00 PM,每组2~3只大鼠行视频录像监测。 5. 电极置/南/双侧杏仁核 每组抽取2只行深部EEG检测。立体定向置深部电极:双侧海马腹后部(A 5.6 mm,L 4.5 mm,V 6.0 mm),双侧杏仁核(A 1.4 mm,L 5.0 mm,V 8.5 mm);地/参考电极置于额骨。检测1~3次/周,2~4 h/次。 6. 染色时间5.2%对苯二酚染色 Nissl染色:光镜计数双侧CA1、CA3区和DG细胞。Timm’s染色:0.2%Na2S处理的标本于固定液(4%多聚甲醛+30%蔗糖)中过夜,冰冻切片30 μm。暗室内染色60~90 min,26 ℃水浴。显影液:30%阿拉伯树胶180 ml+柠檬酸缓冲液30 ml(柠檬酸7.65 g和柠檬酸钠7.05 g)+5.67%对苯二酚90 ml+15%硝酸银1.5 ml。蒸馏水冲洗,苏木素复染细胞核。 7. 统计方法 SPSS10.0统计软件包,实验侧与对照侧数据行成对t检验,各组间数据行方差分析。 结果 1. eeg的癫痫模型 实验动物根据症状分急性期(注射KA后约4~7 d)、静止期(急性期后10 d~2月)、慢性期(大鼠出现自发性癫痫发作以后)。急性期:出现上肢抖动、向左侧翻滚转圈、肢体强直等癫痫表现,持续3~5 h。EEG局限于实验侧海马的丛集放电,扩展至边缘系统的其他结构,其间有发作后抑制。静止期:症状消失,EEG趋于正常,偶有慢波和尖棘波。慢性期:出现反复自发性癫痫发作,类似杏仁核点燃发作,持续40~60 s,双侧前肢痉挛、全身抽搐站立和/或摔倒。EEG在海马和杏仁核出现发作性棘波活动,双侧均可见。 2. 海马ca1和ca2 急性期:明显神经元变性、死亡,细胞结构瓦解。实验侧海马CA3区最早最明显,对照侧轻,两侧差异有显著性(P0.05);CA1和CA2病变轻,两侧差异无显著性(P0.05);齿状回(DG)无显著神经元缺失。DG无明显苔藓状纤维(MF)发芽。静止期:实验侧海马CA3、CA4区神经元缺失,达90%以上;胶质细胞增生。DG的浅颗粒层和内分子层开始出现MF发芽,并逐渐增加。慢性期:神经元缺失,胶质增生,海马萎缩。齿状回MF发芽进行性增加。海马CA3区锥体细胞变化见表1。 讨论 1. 症状和eeg表现为 本模型明显地分为急性期、静止期和慢性期,有如人类TLE病程的缩略版。 2. 近隔损害的模型 神经元死亡:海人酸受体为离子型谷氨酸受体,在海马CA3区特异性高亲和力受体最多,因此CA3区最容易出现神经元过度兴奋而致神经元死亡。局部损害:在注射局部,KA与受体结合产生强烈的除极,当能量耗竭细胞内环境紊乱,细胞即死亡。远隔损害:(1)非选择性抽搐相关损害:主要在CAl区,与KA注射部位无确定的突触联系。损伤可以被抗痉挛剂阻断,与脑组织的血流/氧耗比下降所引起的缺血-缺氧有关。(2)选择性抽搐相关损害:主要在CA3区,与癫痫放电的突触传播有关。损害与抽搐的时程和间隔有关,KA模型急性期癫痫持续状态致明显神经元死亡,而点燃模型无明显神经元缺失。可能的死亡机制有:(1)钙超载学说。(2)锌毒性:MF在脑内锌含量最丰富,其去极化使Zn2+水平升高100倍以上,降低Zn2+水平可减少刺激MF所引起的CA3区放电。 3. mf异常发芽与自身胞体或树突形成突变体的自反馈 MF发芽形成的神经回路可使颗粒细胞的兴奋性增高,与癫痫放电的产生和传播有密切关系。MF以CA3区锥体细胞为靶点,CA3区锥体细胞死亡使MF失去靶点,从而MF异常发芽与自身胞体或树突形成突触,形成自身反馈的兴奋性突触;另外内分子层的传入纤维起始于门