白花丹参总丹参酮对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型的治疗作用.docxVIP

白花丹参总丹参酮对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型的治疗作用 动脉硬化性血栓形成（tho）是一种特定的非动脉硬化性疾病，主要影响小腿骨和周围血管，主要影响下肢中的小动脉和静脉。其临床特点为患肢皮肤发凉、间歇性跛行, 严重者有肢端溃疡或坏死, 是我国慢性周围血管病中较常见的病种。白花丹参 (Salvia miltiorrhizaBunge f.alba) 是唇形科植物丹参的变型, 主产于山东, 根入药。除具有丹参的作用和用途外, 临床发现白花丹参对治疗TAO具有独特疗效, 为了探讨白花丹参治疗TAO的有效物质及其机理, 本文从体征、病理变化及血清中TXB2、6-K-PGF1α、ET等方面观察了白花丹参总丹参酮对TAO大鼠模型的影响。 1 材料表面 1.1 实验动物 Wistar雄性大白鼠60只, 体质量280～300 g, 由山东大学实验动物中心提供。 1.2 化学试剂及试剂 白花丹参总丹参酮提取物 (由本实验室制备) 、LCMS-2020色谱仪 (岛津公司) 、乙腈 (色谱纯) 、冰乙酸 (分析纯) 、通塞脉片 (江苏南星药业有限责任公司) , 批号:月桂酸 (国药集团化学试剂有限公司) , 批号:F200909284;血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、ET酶免试剂盒 (RD公司) , 批号。 1.3 高效液相色谱法 取白花丹参总丹参酮提取物约5 mg, 精密称定, 置5 mL容量瓶中, 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 滤过即得。参照文献采用Agilent Eclipse XDB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm i.d, 5 μm) 色谱柱;以乙腈为流动相A相, 以0.1%乙酸水溶液为流动相B。线性梯度洗脱时间程序为0 min, 20%A;20 min, 60%A;50 min, 80%A;流速0.8 mL/min;UV检测波长270 nm;进样量10 μL。 2 方法 2.1 模型制备和给药 60只大鼠随机为假手术组 (6只) 、模型组 (10只) 、通塞脉片阳性对照组 (10只) 、白花丹参高剂量组 (11只) 、中剂量组 (12只) 和低剂量组 (11只) 。参照文献方法稍加改进, 制作TAO模型:将大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉, 右下肢股内侧剪毛。酒精皮肤消毒, 纵行切开约1.5 cm切口, 游离股动脉, 用动脉夹阻断血流, 假手术组于动脉夹下方远心端注入0.2 mL生理盐水, 其余大鼠注入0.2 mL月桂酸。各组均于注射月桂酸后15 min去掉动脉夹, 缝合皮肤, 观察结果。各组均于手术前灌胃给药, 通塞脉片对照组给通塞脉片0.66 g/kg, 高剂量组给白花丹参总丹参酮提取物40 g/kg (相当于生药浓度) , 中剂量组给白花丹参总丹参酮提取物20 g/kg, 低剂量组给白花丹参总丹参酮提取物10 g/kg。假手术组和模型组均给予等容量羧甲基纤维素钠溶液, 1次/d, 连续1 w。 2.2 疾行状况分级标准 大体观察大鼠患肢皮肤颜色、温度、患肢有无肿胀、有无坏疽及坏疽的程度、跛行状况。参照王军等采用的分级标准分级, Ⅰ级:病变局限于趾甲部;Ⅱ级:病变局限于趾部;Ⅲ级:病变局限于足爪部;Ⅴ级:病变局限于膝关节以下;V级:病变发展到膝关节以上。 2.3 纤维组织病理学观察 全部送检的截肢标本解剖出月桂酸注射处以下部位的动脉、静脉主干, 4%多聚甲醛固定, 石蜡包埋、切片、常规HE染色, 观察血管平滑肌、纤维组织病变情况。同时分别对动脉壁炎性细胞浸润、纤维增生等情况进行观察。 2.4 血浆txb2、6-k-pgf1、et试验 采用酶联免疫法测定, 具体步骤参照说明书。 2.5 统计处理 实验数据用xˉ±sxˉ±s表示, 计数等级资料采用秩和检验, 计量资料采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析处理。 3 结果 3.1 紫外吸收色谱图 /UV/MS图谱获取 按“1.3”项下色谱条件, 对白花丹参总丹参酮的主要成分进行分析, 所得到紫外吸收色谱图 (图1-A) 与总离子流色谱图 (图1-B) 基本吻合。应用ESI-MS技术, 对总离子流色谱图中的各色谱峰经质谱扫描后得到一级质谱图, 按各色谱峰的质谱图与文献核对, 对相应的化合物进行了结构推测, 结果见表1。 3.2 肢体长期造模肢体劳动 大鼠经股动脉注入月桂酸造模后, 各鼠患肢皮肤温度降低, 约5 min后足爪部开始出现不同程度的苍白, 肿胀。次日造模成功的大鼠均出现造模肢体缺血表现、跛行或拖曳现象、肢体青紫颜色加深并逐渐向上发展。一周内有部分大鼠出现肢端糜烂、溃疡及炎症反应, 有脓液渗出, 恶臭味, 少数大鼠出现患侧坏疽部分脱落, 患肢的胫后肌群出现严重坏死。模型组的病变最严重, 通塞脉片组与中、高剂量