实验小鼠胚胎移植的实验研究.docxVIP

实验小鼠胚胎移植的实验研究 自20世纪50年代以来，人类建立了精子和早期胚胎采集技术，并很快完成了从早果到代母的胎盘移植技术的开发和研究。小鼠的胚胎移植技术对于实验动物学研究及生命科学研究具有重要价值。人类由小鼠进行发育生物学研究,包括胚胎的发生、发育、突变基因的研究、转基因动物的研究、基因打靶技术及小鼠胚胎冷冻种子库技术等涉及胚胎体外操作的各种研究,均需要进行胚胎移植入代母体内来完成。按照胚胎发生的阶段不同,移植部位也不同。1~2个细胞期胚胎进行输卵管口移植,8细胞期至桑椹期胚进行子宫移植。1992年,日本学者Nakagata又报道了经由输卵管壁进行输卵管移植的技术,以解决移植中一些代母品系输卵管口较小、较短的问题。 本文主要是将此三种移植方法引入,使之在本实验室成为常规后,将其应用于实验小鼠并进行了方法上的比较,重点比较了方法上的难易程度、产仔率、方法选择的前提因素。 1 材料和方法 1.1 实验动物 实验动物作为参比对照的成年近交系C57BL/6J小鼠、BDF1小鼠(♀C57BL/6J×♂DBA/2)和作为代母的昆明种封闭群小鼠。 1.2 培养基和培养方法 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin)、HCG(human chorionic gonadotropin)、胚胎移植用Injection Medium培养液、M2培养基等。 1.3 假怀孕和代母的准备 1.3.1 结扎手术 为输卵管移植及子宫移植用代母(昆明种封闭群小鼠)交配用的雄性昆明种小鼠进行输精管结扎手术,以便制备假孕代母。进行输精管结扎手术的雄性昆明种小鼠应提前三周施行手术,术后备用。 1.3.2 阴道栓治疗 胚胎移植前一日(子宫移植,前三日)将已施行输精管结扎手术术后三周的昆明种雄性小鼠以1∶2与其雌性小鼠进行同笼交配,次日检查阴道栓有无,以阴道栓形成者作为移植用代母。 1.4 卵产 1.4.1 hcg超排 取出生后8~10周的C57BL/6J及BDF1雌性小鼠进行PMSG处理(腹腔注射,5IU/只),48h后进行HCG超排卵处理,方法、剂量相同,HCG处理14~17h后可进行受精卵的采集(子宫移植,为HCG处理后第三日)。 1.4.2 接口配置 取已注射PMS、HCG后的C57BL/6J、BDF1雌性小鼠与其相应的C57BL/6J、BDF1雌性小鼠进行同笼相配,比例为1∶1。 1.4.3 明质酸酶培养液的制备 a.取同笼相配后阴道栓阳性的雌性C57BL/6J、BDF1小鼠,断椎处死后仰面(腹部朝上)置于解剖台上,酒精消毒后剪开外皮、真皮、打开腹腔,剪下卵巢、输卵管连同输卵管壶腹部后,置于盛有PBS的平皿中,镜下找出输卵管的壶腹部并用游丝镊子撕破,使其中的受精卵释放到带有透明质酸酶的培养液中,用受精卵采集毛细管将培养液中的受精卵转移至盛有三滴(400ul/滴)受精卵培养液平皿中的一滴,用同样方式再洗二次后最终将受精卵置于微滴培养液(50ul/滴)中,放入37℃、5%CO2中温育3~4h,等待移植。 b.采取子宫移植的方法,将同笼相配后阴道栓阳性的雌性C57BL/6J、BDF1小鼠挑出,单独饲养至第3d(8细胞期胚)处死,剪开外侧皮肤后将内侧皮肤剪为“横T”型,打开腹腔后找出子宫及卵巢,剪断取出放入盛有PBS缓冲液的平皿中,并剪掉系膜及附着物后放入盛有M2培养液的平皿中,在M2平皿中将子宫与卵巢连接的根部剪断并作“十”字切口,在1mL针管中吸入0.5~0.6mL M2液从阴道根部扎入到子宫中将M2冲入到子宫中,反复3次冲洗后用8细胞胚采集用毛细管吸入后移至盛有三滴M16培养液平皿中的一滴,同样方式再洗二次后置于第三滴M16中,放入37℃、5%CO2中温育,等待移植。 1.5 胚胎移植 1.5.1 代母使用卵巢膜 麻醉代母并进行胚胎移植显微手术。消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,镜下取出卵巢部,剪开卵巢膜,将2个细胞期胚经代母输卵管伞口移植入代母输卵管中。将卵巢部轻推小鼠体内,进行真皮毛皮术后缝和,消毒伤口后,注意保温,第二日观察至苏醒后置于小鼠饲育室中至仔鼠出生。 1.5.2 离子交叉移植 麻醉代母并进行胚胎移植显微手术。消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,镜下取出卵巢部,剪开卵膜,确认输卵管伞端后,在输卵管伞端至壶腹部之间靠近壶腹部1/3处的输卵管壁切一斜口(250μm左右),将受精卵经由此剪开的斜口移植入壶腹部内。将卵巢部轻推小鼠体内,进行真皮毛皮术后缝和,消毒伤口后,注意保温,第二日观察至苏醒后置于小鼠饲育室中至仔鼠出生。 1.5.3 多轴经皮固定 麻醉代母并进行胚胎移植显微手术。消毒杀菌后,剪开毛皮层、真皮层,镜下找出一侧子宫,左手以游丝镊子轻轻夹住子宫与输卵管结合部使子宫与鼠体成45℃角,右手用5#针头经由子宫壁扎入