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纤维素酶处理对黄芪多糖提取效果的影响 近年来，酶法用于提取草药的有效成分。通过选择合适的酶法，可以提高枣、蛋白质、黄酮和多糖等活性成分的产量。关于酶法提取多糖已经有些报道,常用的酶制剂包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶。黄芪的药用部位为根,多糖是其主要的功效成分之一。黄芪多糖几乎均以α-糖苷键相连,且有的多糖属于果胶类多糖。中草药的细胞壁大多主要由纤维素构成。黄芪原料及药渣中纤维素的质量分数较高,分别为26%和48%左右。因此,结构多糖中的纤维素可能是制约黄芪多糖最大限度溶出的主要物质。纤维素是由D-葡萄糖β-1,4糖苷键连接而成,纤维素酶则能特异性地降解纤维素生成葡萄糖等低相对分子质量的糖。因此,本研究探讨纤维素酶法提取黄芪多糖,旨在提高黄芪多糖的得率和最大限度地利用黄芪资源。 1 材料和方法 1.1 仪器、设备和仪器 回流提取装置(规格为1 L和10L),实验室组装;TU—1800SPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),AB204—B型电子分析天平(瑞士梅特勒公司),LGJ—18型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂),—Ⅱ低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂),SCD005 Sputter Coater离子溅射金,FEI QUANTA 200扫描电镜(PHILIP)。 1.2 聚合物的制备 黄芪为山西产蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao(炮台芪),由北京同仁堂饮片厂提供。提取用水均为蒸馏水,分析用水均为双蒸水。葡萄糖对照品(Sigma公司),重蒸酚、乙醇、硫酸等均为国产分析纯,纤维素酶(初始活力单位1 800 U/g,唐山太博尔生物工程有限公司)。 1.3 浓硫酸总用量的测定 采用苯酚-硫酸法测定多糖。精密取2 mL样品溶液,分别加入5%苯酚溶液1.0 mL,摇匀,迅速加入5.0 mL浓硫酸,振摇5 min,置沸水浴上加热15 min,然后置冷水浴中冷却30 min,随行空白对照,在490 nm波长处测定吸光度。用标准曲线计算多糖量。 2 结果分析 2.1 总糖与还原糖质量浓度的测定 称取一定量的黄芪粗粉,加入10倍量水,提取2 h后滤过,滤渣均分。每份折合黄芪生药10 g,置于消化管中,升温至所需温度,加酶保温。迅速升温至沸腾继续提取1 h,3 000×g离心15 min,测定提取液中总糖和还原糖的变化。分别进行纤维素酶加入量、酶处理时间和温度对黄芪多糖提取的影响试验,试验重复3次,各指标取平均值。文献报道将总糖与还原糖质量浓度之差作为多糖质量浓度。考虑到黄芪中含有较多的蔗糖,由于蔗糖极易溶于水而被提取出来,总糖与还原糖质量浓度之差的变化能近似反映出黄芪多糖质量浓度的变化。所以,本研究以总糖与还原糖质量浓度之差为主要指标考察纤维素酶对黄芪多糖提取的影响。 2.1.1 时间单位的确定 将滤渣加入8倍量水,纤维素酶加入量分别为0、30、60、90、120、150 U/g生药,处理温度为50℃,处理时间为2 h。纤维素酶加入量对黄芪多糖提取的影响见图1。可以看出,还原糖和总糖的质量浓度均随着加酶量的增加而逐渐增大,其中还原糖的质量浓度随加酶量的增加几乎呈直线增加,而总糖增加的趋势则随加酶量的增加渐缓。加酶量从30 U/g增至60 U/g时,总糖与还原糖质量浓度之差大幅度增加;从60 U/g增至150 U/g的过程,增长趋势比较平缓。 2.1.2 保温温度 将滤渣加入8倍量水,根据加酶量的试验结果,取加酶量为60 U/g生药,分别保温0、30、60、90、120、180 min,保温温度为50℃。纤维素酶处理时间对黄芪多糖提取的影响见图2。可以看出,随酶处理时间的增加,还原糖和总糖的质量浓度不断增加。反应时间由0～90 min这一阶段总糖与还原糖质量浓度之差大幅上升,几乎呈线性增长,从90～180 min这一阶段的上升趋势逐渐平缓。 2.1.3 不同温度对黄芪多糖提取的影响 将滤渣加入8倍量水,加酶量为60 U/g生药,根据酶处理时间的试验结果,保温时间90 min,保温温度分别为35、40、45、50、55℃。不同温度对黄芪多糖提取的影响见图3。结果表明,酶处理温度从35℃逐渐增至55℃时还原糖在50℃时质量浓度较高,其他温度下差别不大;总糖、总糖与还原糖质量浓度之差在35～50℃逐渐上升,在45～50℃达到最大值,之后又慢慢下降。 综合以上纤维素酶处理各因素对黄芪多糖提取的影响,得到纤维素酶处理的最佳条件为:加酶量60 U/g,酶处理时间90 min,处理温度50℃。 2.2 工艺方法的提取工艺2. 根据所得到的纤维素酶处理的最佳工艺条件提取黄芪多糖。酶处理工艺为:纤维素