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瓜叶菊‘小径’系列花色品种培养基的筛选 瓜叶菊是蔷薇科植物种类的观赏价值很高的多年生花卉。花期为冬季品种（12月至次年4月）。植株繁茂，花朵繁茂，覆盖着整个植物。色彩丰富多变，再现出温暖的气氛。这是一个重要的节日花卉，具有很高的观赏价值和经济价值。 瓜叶菊主要通过种子繁殖。国内生产中使用的种子均为进口,价格昂贵,种子繁殖系数很低,难以满足市场需求,限制了其产业化和商品化生产。利用组织培养技术进行离体快繁,是快速获得大量优质种苗的有效途径。目前国外对瓜叶菊的研究多数集中在栽培、起源、单基因的分离及功能分析等方面,关于瓜叶菊不同品系离体快繁的相关报道极少。瓜叶菊全株密披绒毛,茎杆粗短,灭菌难度大且材料来源相对较少,给再生体系的建立带来了一定的困难。Iizuka等在1973年利用瓜叶菊的管状花诱导出了愈伤组织,这是对瓜叶菊试管繁殖的最早尝试,但未能建立其稳定的再生体系。国内研究者曾利用茎段、叶片、叶柄、花梗和花托为外植体获得了再生植株,但未见移栽试验后关于再生植株开花的后续报道。何少波等利用瓜叶菊的幼叶和叶柄作为外植体,发现愈伤组织诱导率极低,分别为10%和0。本研究首次采用瓜叶菊的种子为外植体直接获得无菌苗,进而通过研究不同生长调节剂种类和浓度组合的作用,探索适于瓜叶菊组培苗不同部位器官离体再生的优化培养基,建立瓜叶菊试管苗组织培养快繁技术体系和植株再生体系,并对不同种子建立的株系花色稳定性进行观察和分析。这一研究对瓜叶菊种质资源的保护、开发利用和开展分子育种研究具有重要意义。 1 材料和方法 1.1 种子和种子接种 试验所用瓜叶菊品种‘小丑’(S.cruentus‘Jester’)5个花色的种子购自美国Gold Smith公司,花色纯正鲜艳,舌状花上色彩分布均匀。用10%的过氧化氢表面灭菌10 min,无菌水冲洗4次,接种于不含生长调节剂的MS培养基上(蔗糖3%、琼脂0.55%,pH 6.1)。每瓶接种5粒种子,每个花色6瓶。培养室温度为(25±1)℃,日光灯光源,光照强度2 000 lx,光周期16 h/d。 1.2 丛生芽的诱导 接种25 d后,将在基本培养基上萌发的无菌苗用手术刀去根后接入含有6--BA 1.0 mg/L的MS培养基上诱导丛生芽,每个花色10瓶,每瓶接种3株。30 d后得到大量的无菌苗,再将其作为外植体接入含有不同浓度6--BA和NAA的MS培养基上(见表1),观察并记录丛生芽诱导情况。每个处理接种10瓶,每瓶接种3株。 1.3 愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基,其中不同种类和浓度的生长调节剂采用三因素四水平的正交设计(培养基配方见表2)。将获得的丛生芽切离,接种在MS培养基中。继代培养25 d后,取无菌叶片和叶柄为外植体,叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块,叶柄用手术刀切成0.1 cm左右的薄片,分别接入愈伤组织诱导培养基上,观察出现愈伤组织的时间、出愈率、分化率等。每个处理叶片和叶柄各接种10瓶,每瓶接种10个外植体。 1.4 愈伤组织增殖 用手术刀把获得的愈伤组织切成0.2 cm×0.2cm的小块,转接到愈伤组织增殖培养基上(见表3)。25 d后统计增殖倍数并观察获得的愈伤组织状态。每个处理接种5瓶,每瓶接种10个外植体。 1.5 根培养基的筛选 将获得的不定芽用手术刀分离,转入生根培养基中(见表4),25 d后统计根数和生根率,筛选最佳生根培养基配方。每个处理接种10瓶,每瓶接种4株。 1.6 试苗的培养 从继代培养的不定芽上剪取长约1.5 cm的顶芽,接种至已筛选出的最佳生根培养基中,约20 d后,不定根长至1 cm时,将瓶盖打开,于组培室炼苗2 d后,将试管苗根部琼脂洗净,移栽于V(蛭石)∶V(珍珠岩)=1∶1的混合基质中,保持基质和空气中的湿度,1个星期后就可以进行常规培养。 1.7 方差分析与多重比较 所得数据采用Microsoft Excel和SPSS11.5软件进行方差分析与多重比较(邓肯式检验,P=0.01),百分数经反正弦(y=arcsin x1/2)转换后再进行分析和比较。 2 结果与分析 2.1 无菌苗萌发率 将灭菌后的种子在MS培养基上播种25 d后进行萌发统计,每个花色均获得了30株无菌苗,萌发率为100%,萌发势整齐,植株生长健壮(图1A)。 2.2 外植体接种对芽增殖的影响 将无菌苗接入含有6--BA 1.0 mg/L的培养基中,芽平均增殖倍数为7.15,将获得的芽用手术刀切离后接入含有不同生长调节剂配比的MS培养基中,试验结果表明,外植体接种30 d后,芽增殖效果明显(图1B),不同花色间有明显差异。从表5中可以看出,大多花色随着生长调节剂浓度的增加芽个数增多,添加6--BA 2.0 mg/L的MS培养基为最佳,增值倍数可达11.10,其次为添加6--BA 1