CRISPR-Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用.docxVIP

? ? CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用 ? ? 于鲲，薛佳琪，王进宽，余永涛* 1.宁夏大学农学院，银川750021； 2.固原市原州区张易镇畜牧兽医工作站，宁夏 固原756022 丝状真菌（filamentous fungi）统称为霉菌，广泛分布于自然界中，因其种类丰富、来源广泛、易于工业化等特点而在多个领域得到广泛应用。曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma）等丝状真菌具有良好的蛋白质合成和分泌能力，常被用于各种同源性或异源性蛋白质表达的生产，如利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过人工生物合成来生产纤维素酶、菊粉酶［1］；用米曲霉（Aspergillus oryzae）生产人乳铁蛋白、小牛凝乳素等。部分丝状真菌还可用于合成有重要生物活性作用的次级代谢产物，如青霉素、洛伐他汀等。在环境保护方面，丝状真菌可用来处理废水、生产生物燃料、降解低密度聚乙烯［2］等。同时，丝状真菌与人类的生产生活密切相关，一些丝状真菌是人或动植物的病原真菌，如镰刀菌属（Fusariumspp.）和曲霉属部分真菌可引起真菌性角膜炎［3］，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）［4］可引起人类真菌性皮肤病；稻 瘟 病 菌（Magnaporthe oryzae）［5］、灰 霉 菌（Botrytis cinerea）［6］等 可 引 起 农 作 物 的 真 菌 性病害。 通过研究丝状真菌生物合成相关基因的功能，并应用生物技术手段对其进行遗传选育或改造，可以显著提升丝状真菌合成生物活性物质的能力，从而达到利用丝状真菌进行工业化生产和应用的目的［7］。基于同源重组原理的基因敲除等技术，如Split-marker、λRed等已广泛应用于丝状真菌基因功能的研究［8］。但由于同源重组效率低、脱靶率高、需要对大量转化子进行筛选、工作量巨大等因素，近年来已逐渐被基因编辑等技术所替代［9］。近年来，科研人员陆续开发了多种用于基因编辑的特异性核酸内切酶技术，如锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、类转录因子样效应核酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）、CRISPR/Cas9等技术，与ZFN技术［10］和TALEN技术［11］相比，CRISPR/Cas9技术具有操作简单、靶向性好、安全性高等优点，已经成为丝状真菌基因编辑的首选技术。本文综述了CRISPR/Cas9技术的起源与基本原理，sgRNA的合成策略，Cas9蛋白、CRISPR/Cas9系统的递送、实现基因编辑的方式和存在的问题，以期为该技术在丝状真菌中的应用提供理论依据。 1 CRISPR/Cas9技术的起源与基本原理 1987年日本微生物学家Ishino等［12］首次在大肠杆菌中发现了成簇而规律地间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。2002年Jansen等［13］发现了与CRISPR序列相邻的Cas基因，并且在细菌（＞40%）以及古细菌（＞90%）中都存在这一系统，同时证实这一系统与细菌免疫有关。随着研究的深入，该系统的各组成成分及功能逐渐被揭示。2013年该系统首次被应用于基因编辑，随后该系统被广泛应用于植物［14］、动物以及微生物［15］的基因编辑中。2015年Liu等［16］首次将CRISPR/Cas9技术运用于丝状真菌模式生物—里氏木霉（Trichoderma reesei）中，之后在多种丝状真菌的基因改造中得到广泛应用。 目前，被广泛应用的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统来自于化脓性链球菌，该系统主要由两部分组成：一个组成部分是通过碱基互补配对方式对目的基因编辑区域进行定位的向导RNA（small guide RNA，sgRNA）；另一组成部分是通过PAM序列（5-NGG-3）与靶向DNA结合且具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白。sgRNA引导Cas9蛋白与靶向序列结合后实现对DNA双链的切割［17］。DNA双链断裂后，细胞内启动非同源末端连接或同源重组修复机制来重新连接断裂双链，在此过程中实现基因的敲除或替换。 2 丝状真菌中sgRNA的表达策略 sgRNA作为CRISPR/Cas9系统的重要组成部分，其能否正确表达是基因编辑成功的关键因素，而合适的启动子才能高效驱动sgRNA的表达来实现基因编辑，因此选择合适的启动子对sgRNA的表达至关重要。gRNA在真核细胞内的表达通常分为RNA聚合酶Ⅲ启动子驱动和RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动两种表达策略。 2.1 由RNA聚合酶Ⅲ启动子驱动sgRNA表达 sgRNA转录完成