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度烧伤创面原位再生修复过程中不同活组织k19的表达 1 皮肤损伤的治疗 本组病例为我院2001年7月至2002年12月住院患者，其中8名男性和2名女性，年龄最低，最高年龄为39岁，平均年龄为27岁，烧伤总面积（52.2.34.64）%，i级烧伤（9.6.69）%。级烧伤的所有伤口均通过病理切割后，所有伤口均为皮肤层坏死。重点是四肢上的损伤伤口，包括5只上肢和5张下肢。 全身治疗方法同常规治疗。局部治疗:10例患者入院后常规行湿性医疗技术加外用重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF)治疗。 在获得了患者及其家属的知情同意后,在距Ⅲ度烧伤创面边缘约4cm处用手术尖刀分别切取伤后3～6d的痂下活组织、伤后25～32d的肉芽样组织、早期再生组织(创面刚愈合时)以及晚期再生组织(创面愈合后1年),每次切取的组织块大小约1.0cm×0.5cm×0.8cm,行常规病理学检查以及免疫组织化学染色检查。另外,选择既往我院手术治疗的6例外院诊治3个月以上未愈的慢性皮肤溃疡标本做对照,取2例整形患者供皮区的正常皮肤组织作阳性对照。 1 样品处理和检测细胞表达 小鼠抗人K19型单克隆抗体和过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF,2000IU/ml,商品名:金因肽)购自深圳华生元基因工程发展有限公司。美宝湿润烧伤膏(MEBO)购自北京光明中医烧伤创疡研究所汕头美宝制药厂。 恒冷冰冻切片机(Leica CM1800,德国)。华利生物组织自动脱水机(江苏)。华利自动包埋机(江苏)。轮转切片机(ZEISS,德国)。恒字电热恒温培养箱(上海)。显微照相系统(ZEISS,德国)。 所有标本经石蜡包埋,系列切片,厚度为5μm。将切片随机分成两组,分别用于常规病理学检查(HE染色)和免疫组织化学染色检查。 石蜡切片常规脱蜡至水后,用苏木精-伊红染色法染色,光镜下观察。 应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以小鼠抗人K19型的单克隆抗体来检测K19表达阳性细胞。实验操作按试剂盒说明书进行。 石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O237℃孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性。PBS漂洗后置于0.01mol/L,PH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复,5%正常山羊血清封闭后加入一抗,4℃过夜。PBS冲洗,滴加生物素标记的二抗37℃孵育15min,PBS漂洗,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,37℃孵育15min后DAB(二氨基联苯胺)显色,苏木精复染,常规脱水、透明、封片,显微镜下观察。细胞胞浆染成棕黄色为阳性细胞,同时设不加一抗的阴性对照。 2 早期再生组织病理学检测 10例患者的Ⅲ 度烧伤创面上的脂肪组织逐渐被肉芽样组织代替,伤后25～32d的肉芽样组织中开始长出皮丁,以后皮丁逐步形成皮岛,最后融合成片直至痊愈,愈合时间为(39.2±7.3)d。愈后不久,再生组织逐渐出现疤痕增生,经抗疤痕防治1年后再生组织逐渐变成平软而富有弹性的组织。 痂下正常活组织常规病理学检查为脂肪纤维组织,部分变性坏死,大量中性白细胞.淋巴细胞浸润;肉芽样组织常规病理学检查为炎性肉芽组织;早期再生组织常规病理学检查示表皮层较正常皮肤的表皮层明显增厚,表皮脚发达;晚期再生组织常规病理学检查示正常皮肤;慢性皮肤溃疡组织常规病理学检查示慢性皮肤溃疡。 正常皮肤只有表皮基底层和附属器部分细胞表达K19。伤后3～6d,10例患者的痂下活组织均未发现K19表达阳性细胞。肉芽样组织有部分细胞表达K19;早期再生组织检测结果示:在再生表皮的中部,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞,且分布广泛而有规律;晚期再生组织检测结果显示:与正常皮肤类似。6例外院诊治的慢性皮肤溃疡标本均未发现K19表达阳性细胞。 3 表皮胞技术的应用 角蛋白(keratin)是一种直径为10nm左右的纤维状蛋白,是上皮细胞的结构蛋白和主要蛋白,在细胞内形成广泛的网状结构。角蛋白作为表皮或上皮细胞特有的一类蛋白,在机体内至少有20种不同类型,随着细胞分化的进程,可以检出它们逐渐表达不同的角蛋白,如有丝分裂后分化细胞表达K1、K10,短暂扩充细胞表达K5、K14,表皮干细胞表达K19,其中,K19的分子量为40kDa,是角蛋白家族中最小的成员,在皮肤中的表达随年龄的增加而减少。自从1995年Michel M等采用双标记方法证明毛囊里的K19表达阳性细胞正是[3H]胸腺嘧啶核苷标记滞留细胞以来,K19单克隆抗体就被广泛用于检测表皮干细胞。 应用过氧化酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化法,以小鼠抗人K19型的单克隆抗体来检测角蛋白19在Ⅲ度烧伤创面修复过程中的表达特征时,作者发现:⑴Ⅲ 度烧伤创面经湿性医疗技术加外用重组人表皮生长因子衍生物(rhE