慢性氟中毒对小鼠切牙成釉细胞骨形成蛋白-2表达的影响.docxVIP

慢性氟中毒对小鼠切牙成釉细胞骨形成蛋白-2表达的影响 bmp-2被认为是牙齿发育过程中的一个重要信号分子，它调节着瓷器细胞的分化和生长。氟斑牙致病机制目前仍不明确,氟对参与牙齿发育过程的信号分子的影响的报道较少。本实验以慢性氟中毒小鼠下切牙为研究对象,观察在成釉细胞分泌期,BMP-2在成釉器细胞内的表达以及BMP-2在成釉细胞在不同分化时期的表达,为氟斑牙致病机制提供理论基础。 .1.1试验方法 1.动物模型制备:选用健康雄性昆明小鼠18只(第四军医大学实验动物中心提供),体重20～25g,随机分为三组,每组6只,随机编号后分为对照组,低氟组,高氟组。每组小鼠隔离喂养,自动饮食。对照组,饮用去离子水;低氟组饮用去离子水配制50mg/L氟化钠溶液;高氟组饮用去离子水配制100mg/L氟化钠溶液。小鼠每日饮水量4～6g。各组均饲以常规饲料。 2.病理标本制备:喂养45天后,处死动物,仔细解剖分离下切牙,40g/L甲醛固定24小时,100g/L EDTA脱钙3周,常规脱水,石蜡包埋,进行下切牙唇舌向切片,切片厚5μm。常规透明脱水,HE染色,SABC免疫组化染色,光镜下观察。 3.免疫组化主要试剂:BMP-2单克隆抗体,SABC试剂盒,DAB试剂盒均购自武汉博士德公司。 4.免疫组化染色:采用SABC法。切片脱蜡至水,3%H2O2室温下浸泡10min以消除内源性过氧化物酶,复合消化液10min,正常羊血清孵育30min,滴加一抗(1:50),4℃湿盒过夜,37℃复温1h,滴加生物素化二抗(1:100),37℃孵育30min,SABC(1:100)37℃孵育30min,DAB显微镜下控制显色5～10min。上述各步之后均用0.1mol/LPBS振洗3次,每次5min。苏木素复染,常规脱水,二甲苯透明,封片。免疫组化同时作相应的阳性对照和空白对照,以PBS液代替一抗作空白对照,以牙周围骨基质作阳性对照。采用德国Leica图像信号采集分析系统进行灰度分析。 氟同型的出现 1.HE染色光镜观察:对照组:增殖分化期,小鼠切牙唇侧基底部末端成釉器细胞紧密排列成团。细胞椭圆形,密集、无规则排列。核深染,核大胞浆少。可见到核分裂相。分泌前期,随着向切端侧移行,内釉上皮细胞逐渐面向星网状层整齐排列,呈柱状,高度逐渐增加。内釉上皮细胞与星网状层细胞之间出现一层扁平状中间层细胞。分泌期,成釉细胞呈高柱状整齐排列,细胞核位于远心端。成釉细胞牙本质侧出现托姆斯突,进行釉质蛋白的合成,并通过托姆斯突分泌。成釉细胞与成牙本质细胞间可见红染的釉基质,均匀排列整齐,呈现晶体状(图1)。随着釉基质分泌减少直至釉质成熟,成釉细胞高度逐渐降低。高氟组:从分泌前期开始出现变化,细胞有丝分裂相明显减少,一些细胞内含较大的黑色颗粒。分泌期内釉上皮细胞排列不整齐,扭曲变形,细胞间隙增宽,正常的柱状形态丧失;胞浆内出现空泡,大小不均的黑色颗粒;托姆斯突不规则,在部分内釉上皮细胞甚至完全缺失,部分区域托姆斯突被侧向异位物质压迫,在细胞下形成囊泡;釉基质易断裂,不均匀,形状不规则(图2)。分泌期向釉基质矿化的过渡期,细胞远端部分出现大空泡和黑色颗粒,托姆斯突变为不规则的多形性。这种形态学变化持续到釉质成熟期,直至细胞高度降低,变为矮柱状。低氟组:氟中毒引起的细胞变化较高氟组不明显,但仍可见部分细胞扭曲变形。 2.免疫组织化学光镜下观察:BMP-2阳性表现为细胞内棕黄色的颗粒。在成釉细胞,中间层细胞,星网状层细胞,成牙本质细胞,牙乳头细胞内均有表达。灰度值分析如表1(灰度值与表达强度成反比)。 BMP-2在成釉细胞、中间层细胞、星网状层细胞、成牙本质细胞、牙乳头细胞中均有表达(图3)。在成釉细胞、成牙本质细胞中表达最强,牙乳头细胞中表达最弱。实验组随着氟浓度的升高,BMP-2表达逐渐减弱(图4)。 BMP-2在分泌期表达最强,分化期表达最弱;随着氟浓度升高,表达逐渐减弱。 bmp-2mrna的表达 小鼠切牙是无根牙,在其一生中都能持续不断的产生牙釉质,在同一颗切牙上可以同时观察到牙胚细胞的分裂、增殖、分化、成熟,直到牙齿萌出阶段为止的牙齿发育全过程,因此已成为牙齿发育研究非常理想的动物模型。牙胚发育中,骨形成蛋白-2 (bone morphogentic protein-2,BMP-2)作为上皮-间充质相互作用的继发调节信号,参与牙齿发育。本研究通过建立小鼠氟斑牙模型,以下切牙为研究模型,采用免疫组化技术,观察BMP-2在小鼠氟斑牙切牙成釉器细胞内的表达,探讨BMP-2在氟斑牙发生中的作用,为氟斑牙发生机制研究奠定理论基础。 有研究表明大鼠牙胚BMP-2 mRNA首先在帽状期被检测出来,在胚胎第14天(embryo 14,E14下同),局限于牙尖部的内釉上皮细胞,2天后在上皮中的转录丧