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上海青小菜蛾叶片超氧化物损伤机制研究 植物与昆虫物种之间的相互作用的研究在生态理论和实际生产中起着极其重要的作用。近年来,已有许多研究工作,证实了害虫的胁迫能引起植物的生理应激反应,产生了如黑芥子硫苷酸钾、HCN、光敏剂单宁酸、刀豆氨酸和副刀豆氨酸、蛋白酶抑制物、葫芦素、氯原酸和酚类化合物[9,10,11,12,13,14]等对昆虫有防御效应的物质。同时,植物对害虫的应激反应还表现在保护酶活力的增强,如几丁质酶。对植物中保护酶活性变化的研究,多集中于植物对病原菌和其它生理胁迫所造成的反应,而对昆虫取食引起植物保护性酶的研究还比较少。昆虫为害还会造成植物体内营养物质含量的变化,如棉铃虫为害诱导棉花植株还原糖和游离氨基酸含量的变化;松树受马尾松毛虫为害后植株内氨基酸含量发生变化。而植物营养物质含量的变化反过来会影响昆虫的发育,如棉花上的氨基酸含量的变化影响棉蚜的生存。 本文拟将对青菜主要品种上海青受小菜蛾取食为害后的叶片内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性在一天内的动态变化及酚类物质的变化情况进行测定,探讨这些酶和酚类物质在上海青防御小菜蛾时的作用,为蔬菜抗虫育种以及小菜蛾的持续控制提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 对未被对多对正常叶的测定 以在福州种植面积最大的青菜品种上海青及小菜蛾为实验材料。种植上海青于花盆中,每盆一株。实验时,取30d 左右,长势整齐一致的上海青,于早上8:00,每株接3～4龄的小菜蛾幼虫5头。测定酶活力时,5头虫都接在一片叶上。测定总酚量时,5头幼虫则分散接于植株的各叶片上。按0.5,1.0,3.0,7.0,12.0,24.0 h的间隔,用剪刀剪取受害叶、受害植株上的未被取食叶,保存于-20℃冰箱中,以备测定。同时,剪取未受害植株的正常叶作为对照。设置3个重复。 1.2 酶活性测定 1.2.1 活性的测定 称取0.5g叶片,加入2ml 50mmol/L pH7.0 的PBS(含1%PVP),在冰浴中研磨成匀浆。匀浆液用冷冻离心机10000rpm下离心10min后,上清液备用,供SOD、CAT和POD的活性测定。称取0.5g叶片,加入预冷的0.2mol/L pH 5.5的PBS,在4℃下研磨,以转速10000rpm离心30min,上清液即为PPO酶粗提液。 1.2.2 活性测定与ppo活力测定 SOD活性测定参照朱广廉的方法,CAT活性测定参照碘量法的方法进行,POD活性测定参照华东师大的方法进行,PPO活力测定参照叶明志(1996)方法进行。 1.3 研钵加匀浆配制 取蔬菜叶片10g,加20ml乙醇,2ml 10%三氯乙酸,于研钵中匀浆,将匀浆液转入50ml容量瓶中,用10%三氯乙酸定容至刻度。静止30min,用垫有滤纸的漏斗过滤,收集滤液于试管中。总酚量的测定参照朱广廉的方法。 2 结果与分析 2.1 青冠肺炎关键指标的日周变化 如图1所示,上海青正常叶片的SOD酶活力从上午8:00开始下降,到下午15:00时达到最低值,随后酶活力逐步上升,逐步恢复,到第二天上午8:00又恢复到原值。上海青受小菜蛾幼虫取食为害后,酶活性的日周变化发生了。SOD酶活力从上午8:00到11:00也呈下降趋势,但酶活力比正常叶低。到中午11:00后转为上升,在15:00时达到一个高峰,而此时,正常叶片的酶活力为一天的最低值。而后,酶活力又逐渐下降,从20:00到第二天上午8:00酶活力变化平缓。从总体上来看,受害叶的SOD酶活力较对照有所下降。但受害植株的未被直接取食的叶片,SOD酶活力的变化趋势与正常叶相似(相关系数为0.9289),其SOD活力变化介于为害叶和正常叶之间。 2.2 下8:24 如图2所示,上海青正常叶片的CAT酶活力在上午(8:00～11:00)呈上升趋势,而后急剧下降,在15:00时达到一天的的最低值,随后又开始上升,到第二天早上8:00恢复原值。小菜蛾幼虫取食后的叶片,CAT酶活力在0.5h内急剧上升,而后下降,其酶活力总体比正常叶片低。但在15:00时,正常叶酶活力为一天内最低值时,受害叶的酶活力比正常叶略高。受害植株的未被取食的叶片CAT酶活性变化趋势除刚开始时较低外,其余变化与受害叶相似(相关系数为0.7749),但变化幅度更大。 2.3 温度对pod酶活力的影响 如图3所示,上海青正常叶片POD酶活力先呈下降趋势(8:00～15:00),到15:00降为一天的最低点,而后转为上升,到第二天8:00恢复到原先的活力。受小菜蛾取食为害的叶片,POD酶活力比正常叶片的低,但在15:00时,酶活力比正常叶片高。受害植株的未受害叶POD酶活力一天的变化趋势与正常叶片一致(相关系数为0.9362),但酶活力除15:00时比正常叶稍高外,