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二次胶原酶消化法培养大鼠颅盖骨成骨细胞的研究 在过去10年中，特别是在接下来的几年里，随着细胞繁殖技术的发展，骨细胞和破骨细胞的外部培养开始流行起来。本实验采用二次胶原酶消化法分离新生大鼠颅骨成骨细胞,通过形态学观察、ALP染色、骨钙素测定进行鉴定,得到比较纯化的成骨细胞,为进一步在细胞及分子水平研究骨代谢性疾病打下基础。 1 材料和方法 1.1 骨、组织的提取 参照文献及本实验室常规方法,将新生1～2d的SD大鼠(同济医科大学实验动物中心提供)每次4只,放入75%酒精中浸泡消毒10min,无菌操作取出颅盖骨。将颅骨置于含PBS液的培养皿中,清除骨膜、血管和结缔组织,并用PBS液洗涤3次。然后将颅盖骨移入0.1%胶原酶Ⅰ型消化液的小瓶中(Sigma公司产品)静置15min,以消化清除掉骨髓和纤维组织。再将骨移入另一含0.1%胶原酶Ⅰ型的消化液小瓶中,用眼科剪在消化液内剪碎,37℃振荡消化20min。用吸管吹打数次,将含细胞的消化液移入无菌离心管内,在1000r/min下离心10min,倾弃上清液,沉淀的细胞团块加入5ml含20%小牛血清的DMEM培养基,吹打使细胞悬浮,再静置1～2min,用10ml注射器将含有细胞的培养液吸尽,剩下的即为颅骨碎块弃掉不要。可获得(8～9)×105个细胞。 1.2 培养基和传代培养 将制备的细胞悬液按2×105个细胞培养种于25ml培养瓶中,培养基的量为2.5ml。置培养瓶于37℃,5%CO2培养箱内进行培养。2～3d换药一次。一般于原代培养的10d左右细胞融合进行传代。用0.25%胰蛋白酶消化传代。 1.3 细胞生物学检测 A形态观察,在倒置显微镜下逐日观察细胞形态及数目变化,至细胞出现融合,聚集重叠成结节状。B透射电镜观察第二代培养的细胞经胰酶消化离心成细胞团块,用2.5%戊二醛固定2h,1%四氧化锇再固定1.5h,经梯度丙酮脱水,环氧树脂浸透包埋,超薄切片机切片,常规处理后,用日产EMIOC/CR型透射电镜观察。C碱性磷酸酶(ALP)染色。钙钴法,第二代培养的细胞,从培养瓶内取长有细胞的盖玻片条,丙酮固定片刻,空气干燥,置于β甘油磷酸钠孵育液中2h,蒸馏水漂洗,加入2%硝酸钴5min置换钙,蒸馏水漂洗,再加入0.5%的硫化铵1min,自来水漂洗,镜检观察。D细胞内骨钙素测定:合成及分泌骨钙素是成骨细胞的特征之一。第二代培养的成骨细胞经胰酶消化后,取106个细胞,离心后加入1ml PBS与0.2%trito-x-100(含4mMEDTA)按1∶1混合,静置10min后,用放免法测定细胞内骨钙素的含量(北方生物技术研究所提供放免药盒) 2 结果 2.1 胞浆形态数量的变化 原代培养的新生大鼠颅骨成骨细胞悬液经24h培养,在倒置显微镜下可见细胞贴壁生长,细胞呈三角形,纺缍形和多角形等多种形态。胞浆向外伸展,并伸出突起(图1)。72h后,数量增多且细胞部分相连(图2)。随着培养时间的延长,细胞呈指数增长,细胞体积增大,胞浆丰富。10d左右,细胞融合,相邻细胞彼此贴靠或两者突起相连,细胞边界难以区分,传代培养20d出现结节样物,呈铺石状排列,大多呈立方形。 2.2 基综合体形态 电镜下成骨细胞核呈卵圆形,较大,偏短,高尔基复合体较大,线粒体较多,粗面内质网轻度扩张,常见溶酶体、有衣小泡,糖原颗粒,细胞表面有短小的微绒毛,相邻细胞以突起相连(图3)。 2.3 酸性磷酸酶染色 第二代的细胞经碱性磷酸酶染色后,大多数细胞出现阳性反应,细胞膜及胞浆内颗粒均呈阳性反应,染色呈黑褐色颗粒。 2.4 内骨钙含量测定 培养的第二代成骨细胞融合后,取106个细胞破膜处理测得骨钙素在25.45±5.81ng。 3 体外培养成骨细胞的可行性 骨组织在人的一生中不断更新,是一种代谢很活跃的组织,主要由二种细胞——成骨细胞及破骨细胞发挥作用。成骨细胞是骨发生和骨形成的重要细胞,具有合成、分泌组成骨基质的胶原和糖蛋白的作用,并通过钙化基质形成骨组织。另外,成骨细胞在维持机体内环境的稳定、生理机制调节和骨代谢性疾病中亦发挥重要作用。近几年,随着医学科研水平的高速发展,分子生物学已渗透到医学研究的各个领域。成骨细胞体外培养成功,为其相应的研究提供了基础。 我们用新生大鼠的头盖骨作培养材料,应用Ⅰ型胶原酶进行2次消化,第一次消化可将颅骨表面的纤维组织及骨髓组织去掉。第二次消化可收集到约(8～9)×105个细胞。在含20%小牛血清的DMEM培养基中,在37℃、5% CO2培养箱中培养,获得理想的原代和传代的细胞。经倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、细胞内骨钙素测定,显示具备成骨细胞的功能特点。体外培养的成骨细胞在其生长分化过程中存在着异质性,可能与分离出的细胞成分复杂以及培养条件的影响有关。我们采取分次消化可使细胞的纯度提高。因