健康山羊亚急性瘤胃时下丘脑相关非激素水平的变化.docxVIP

健康山羊亚急性瘤胃时下丘脑相关非激素水平的变化 sara是指周期性或临床上的肿瘤胃酸中毒，是指含有反刍动物和容易分解的碳氢化合物，导致肿瘤胃长期处于低ph值，导致代谢疾病。随着我国乳业的快速发展, 为提高奶牛产乳性能而大量饲喂高能量精饲料, 虽然在一定程度上提高其生产性能, 然而长期饲喂高能量精饲料日粮易导致SARA的发生。近年来, SARA的发生率大幅升高, 严重影响养殖业的经济效益。研究结果表明, 高产奶牛因采食量较多, 患 SARA 的风险性也较大。Allen研究结果表明, 动物发生SARA时, 动物处于一种慢性应激状态, 瘤胃对纤维的消化能力下降和瘤胃液里挥发性脂肪酸上升特别是丙酸盐在瘤胃里的渗透性升高, 从而食欲受到抑制。也有研究报道认为, 谷物诱导的SARA导致血液里急性期蛋白增加, 同时这种炎症反应导致奶牛的摄食下降。然而, 有关SARA时奶牛食欲降低的中枢机制尚未见报道。 采食量的大小直接影响动物的营养摄入和能量、物质代谢。采食量的调控非常复杂, 包括体内外各种因素综合作用。传统的观点认为, 动物的采食主要由下丘脑的摄食中枢和饱中枢控制。中枢的采食调控主要通过食欲调节肽而起作用, 神经肽Y (NPY) 和刺鼠相关蛋白 (AGRP) 是已知的2种最有力的促食欲肽, 可以显著刺激采食, 并且对采食有长期持续影响。NPY的促进采食机制目前尚未定论;AGRP可以与黑素皮质素 (MC4) 的受体结合, 使得黑素皮质素 (MC4) 与其受体结合率降低, 导致黑素皮质素受体 (MC4R) 抑制摄食的功能减弱, 从而达到增加食欲的目的。前阿片黑素细胞皮质激素 (POMC) 和促黑激素受体4 (MC4R) 是已知的降食欲肽。POMC是一类神经肽的前体分子, 在下丘脑中经转录后加工可形成多种肽, 包括:α-促黑色素细胞激素 (α-MSH) 、γ-MSH、β-内啡肽 (β-EP) ,α-MSH通过激动MC4R抑制摄食;MC4R是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质, 为黑素皮质素受体家族5个亚型 (MC1-5R) 之一, 是一个调节能量动态平衡的重要信号分子。目前, 单胃哺乳动物和禽类的中枢食欲调节机制已明确, 而有关反刍动物的中枢食欲调节机制的相关研究甚少。本研究以山羊为研究对象, 探索患SARA食欲降低时中枢摄食调节肽的基因表达的变化, 以期为弄清反刍动物食欲调节的中枢机制提供试验基础。 1 材料和方法 1.1 冷冻离心及pcr检测 TRIzolue4f0 Reagent, 购自上海英俊生物技术有限公司;SYBRue4f0 Premix ExTaqTM, 购自TaKaRa公司;冷冻离心机 (AllegraTM64R, Beckman CoulterTM, USA) ;组织匀浆器;PCR仪 (Stratgene, USA) ;酶标仪 (Synergy, Biotek, USA) ;NanoDrop TM1000 sepctrophotometer (Thermo Scientific, USA) 。 1.2 动物及其饲养方法 选用健康状况良好, 体重15～20 kg干乳期山羊 (波尔山羊与浙江丽水本地山羊杂交后代) 7只, 手术安装永久性瘤胃瘘管, 恢复期为14 d, 饲养于南京农业大学实验动物房, 单笼饲。 1.3 sara试验方法 本试验随机分为2组, 分别饲喂精粗饲料比4 ∶6 (对照) 和6 ∶4日粮 (SARA处理) , 粗料由20%苜蓿草和80%羊草组成。两组日粮总能量和总蛋白含量相等。试验分为两期, 每期包括适应期14 d和采样期5 d, 第一期采样结束后调换日粮。饲料营养成分同以往研究报道。 1.4 样品采集、处理、分析和测定 1.4.1 瘤液ph值和乳酸含量的测定 试验第5 d, 分别于饲喂前0 h, 以及饲喂后1、2、3、4、6、8、12 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃液10 mL (经孔径为0.15 mm尼龙绢过滤) , 测定pH值和乳酸含量。 1.4.2 引物合成及荧光定量分析 试验第5天, 将山羊宰杀后采集下丘脑组织, 迅速置于液氮中保存。采用TRIZOL一步法提取下丘脑样品总RNA, NanoDropTM1000 分光光度法测定总RNA的浓度和纯度 (D260 nm/D280 nm) , 2%琼脂糖凝胶电泳验证引物质量 (图3) , -70 ℃保存备用。反转录酶体系及Taq酶为Promega产品, Sybr购自TaKaRa公司。AGRP、NPY、POMC、MC4R和β-actin引物采用Primer 5.0软件自行设计, 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。β-actin上下游引物序列F:5′-GGAATAGATGCCAAGGGTC-3′, R:5′-CAGAGTTTGGGAGGTGGTC-3′, PCR产物长度12