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益肾护骨方对废用性骨质疏松大鼠的影响 废弃性骨质疏松症通常以不同程度的手术为基础，需要不同程度的下肢运动，如长期河床、运动功能受限和骨折后的所需控制。神经损伤或病变（中枢神经系统、脊髓或周围神经）引起的关节功能丧失和长期全身消耗。该疾病已经成为骨创伤疾病、骨关节疾病及骨关节疾病术后康复的重要障碍,甚至有发生骨质疏松性骨折的风险,影响原发疾病的治疗和康复。本研究前期实验证实在废用性骨质疏松形成过程中,骨形成显著降低持续降低,但速度趋缓,观察最佳时间为造模术后4周或6周。本实验研究益肾护骨方对废用性骨质疏松动物模型血尿生化水平、骨结构及股骨生物力学性能的影响,为益肾活血中药防治废用性骨质疏松提供新思路。 1 材料表面 1.1 实验动物 3月龄SD大鼠70只,雌雄不限,由江苏大学实验动物中心提供。动物许可证号SCXK(苏)2009-0002。 1.2 特效药 1.2.1 药液浓缩组采用水制备工艺 由鹿角片10 g,补骨脂10 g,骨碎补10 g,淮牛膝15 g,熟地黄15 g,当归15 g,白芍15 g,川芎10 g组成,由常州市中医医院制剂室水煎浓缩成至每1 m L药液中含生药1 g。 1.2.2 强骨胶囊 强骨胶囊(北京歧黄制药有限公司,每粒胶囊0.25 g,含骨碎补总黄酮有效成分0.18 g),使用时加蒸馏水制成25 g·L-1溶液。 1.3 试剂与试剂盒 尿羟脯氨酸(HYP)试剂盒、尿肌酐(Cr)测定试剂、血清骨钙素(BGP)放免试剂盒、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Masson三色染色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);B41型光学显微镜(日本Olympus),万能材料实验机(美国BOSE3510),医学图像定量分析系统(上海求为生物科技有限公司MIQAS)。 2 方法 2.1 动物组 2.2 切除坐骨神经 大鼠用10%水合氯醛以30 m L·kg-1行腹腔麻醉后,暴露坐骨神经,于近髋处用锐利刀片切除坐骨神经,长约5 mm,并将神经断端打结处理,逐层缝合切口。肌注庆大霉素0.1 m L,以预防感染。 2.3 同体积的盐水ig 造模后第2天分别予以药物干预,ig给药4周,每日1次,A、B组均正常饲料喂养,自由饮水;C组造模后第2天予以药物组同体积的生理盐水ig;D1,D2,D3组分别于造模后第2天予以益肾护骨方52,26,16.25 g·kg-1ig;E组造模后第2天予以强骨胶囊0.25 g·kg-1ig。各组ig液体量为10 m L·kg-1,其浓度及等效剂量按体重折算。 2.4 测试指标 2.4.1 血液和尿液生化指标的测定 用全自动生化分析仪测定尿Cr,ALP,尿HYP用对二甲氨苯甲醛法测定,血清BGP用放射免疫法测定,TRACP用免疫酶联法。 2.4.2 材料三点弯曲实验 取股骨标本,生理盐水冲净,自凝树脂将样本两端固定于统一包埋深度。样本固定于实验夹上,进行3点弯曲实验。在BOSE3510万能材料实验机上,在变形率为2 mm·min-1恒定作用下对股骨标本施加载荷,股骨标本中点上方有一个压杆。记录股骨断裂过程中力与位移曲线。 2.4.3 远侧干端骨组织形态检测 取各组右胫骨近侧1/3段,10%中性甲醛固定24~48 h,10%中性EDTA液4~8℃脱钙,冠状对剖,70%,80%,90%乙醇顺浓度梯度脱水,组织浸蜡,石蜡包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,镜下观察股骨远侧干骺端骨组织形态改变。光学显微镜下观察,取10×10倍下骨骺线下缘一视野,测节点数和游离末端数。 2.5 数据处理和分析 统计分析采用SPSS 11.5软件包,所有数据行正态分布检验,呈正态分布数据以ue0af±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,组间相互比较采用LSD分析,两组间比较采用t检验。P0.05表示差异有统计学意义。 3 结果 3.1 大鼠患下肢偏行模型 实验中无动物意外死亡,观察各时间段内大鼠体重增长基本正常。C,D1,D2,D3,E组大鼠造模后即出现患肢跛行,至处死仍不能恢复,但均可以3个肢体行走及正常觅食。B组术后1周内即可恢复4个肢体行走及正常觅食。见表1。 3.2 表3显示了血液中alp、bgs、trach和hyp-cr的影响 3.2.1 各组大鼠血bgp比较 C组血BGP与B组相比显著降低(P0.01),予以益肾护骨方干预后,与C组比较,D1,D2,D3组血BGP显著升高(P0.01)。 3.2.4 尿hop/cr比较 C组尿HYP/Cr与B组相比显著升高(P0.01),予以益肾护骨方干预后,与C组比较,D1,D2,D3组尿HOP/Cr显著降低(P0.01)。见表1。 3.3 预后组与c组最大载荷对比 C组股骨最大载荷与B组相比显著升高(P0.01),予以益肾护骨方干预后,D1,D2,D3组最大载荷与