藤茶总黄酮和二氢杨梅素含药血清对hepg2增殖的抑制作用.docxVIP

藤茶总黄酮和二氢杨梅素含药血清对hepg2增殖的抑制作用 藤蔓茶系植物的显齿蛇（handma萨尔）w.t.wang茎叶主要分布在广西、湖南、湖北等地。它很甜，可以清热解毒。主要治疗黄黄疸、肝炎、感冒、咽喉咙痛等。化学成分分析表明藤茶富含黄酮类化合物,总黄酮达40%,其主要成分二氢杨梅素(dihydromyricetin)含量高达25%,药理实验证明藤茶总黄酮及其主要成分二氢杨梅素具有镇痛、降血压、降血脂、降血糖、抑制肿瘤等多种功效。但藤茶总黄酮和二氢杨梅素对肝癌Hep G2细胞的影响尚未有报道。本文拟观察藤茶总黄酮和二氢杨梅素含药血清对肝癌Hep G2细胞的影响。 1 材料表面 1.1 氢杨素3. 藤茶总黄酮由本课题组提取分离(39.8%,其中二氢杨梅素为3.14%);二氢杨梅素(张家界湘汇生物有限责任公司,纯度98.5%,批,用前配制成所需浓度的混悬液;环磷酰胺(山西普德药业有限公司,批。 1.2 实验动物及动物 雄性Wistar大鼠,体重180~220 g,购自上海实验动物中心,许可证号SCXK(D)2008-0026。人肝癌细胞株HepG2购自上海复蒙基因生物科技有限公司。 1.3 药物和微生物 高糖DMEM培养基(Gibco公司);胚胎牛血清(FBS,Hyclone公司);青霉素-链霉素(哈药集团制药六厂);四甲基噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);0.25%胰蛋白酶(Amresco公司);AnnexinV/7AAD细胞凋亡试剂盒(BD pharmingenTM公司)。 1.4 检测显微组织dmiiil Theymo Forma 381型CO2培养箱(美国);DMIIL倒置显微镜(德国);Bio ek标仪(德国);细胞培养瓶(加拿大BIOFIL公司);96孔板(美国CORNNG公司)。 2 方法 2.1 灌胃给药,多次给药 取健康大鼠20只,分为空白对照组(蒸馏水),环磷酰胺组(30 mg·kg-1·d-1),总黄酮组(600 mg·kg-1),二氢杨梅素组(600 mg·kg-1),均灌胃给药,每天2次,连续3 d。于第4天灌胃2 h后,腹主动脉取血,分离血清,于56℃温育30 min灭活,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后分装,置-20℃冰箱保存备用。 2.2 hepg2细胞培养 2.3 高糖dmem培养液制备 取对数生长期HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液将细胞悬液稀释至8×104个/mL,接种于96孔培养板,200μL/孔,待细胞贴壁后吸弃培养液,分别加入含10%,20%,30%空白鼠血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培养液,调零孔不加细胞,只加200μL完全培养液。常规培养24,48,72 h后,于每孔中加入MTT溶液(5 g·L-1)20μL继续培养4 h,终止培养后,小心吸弃孔中液体,加入DMSO 150μL/孔,微型震荡器震荡约15 min,使结晶物充分溶解后,于酶标仪490nm波长处,测定各孔吸光度A。 2.4 血清dmem培养液的测定 操作同2.3,待细胞贴壁后吸弃培养液,分别加入含10%,20%含药血清和空白鼠血清的高糖DMEM培养液,同上法测定各孔吸光度度A。抑制率=(1-A含药血清组/A空白鼠血清组)×100%。 2.5 细胞毒性试验 用倒置显微镜观察细胞形态学的变化,取对数生长期的HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液将细胞悬液稀释至4×104个/mL,于50mL的培养瓶中,待细胞贴壁后吸弃培养液,用含20%的含药血清处理72 h后,直接置于显微镜下观察。 2.6 流式细胞术检测细胞计数 取对数生长期HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液将细胞悬液稀释至8×104个/mL,于50 mL的培养瓶中,待细胞贴壁后吸弃培养液,用含20%的含药血清处理72 h后胰酶消化,PBS洗涤2次,细胞计数收集约1×105个细胞,按AnnexinV/7AAD双标记试剂盒操作进行,1 h内用流式细胞仪检测。 2.7 数据计数和指标分析 应用SPSS 10.0软件包进行数据处理分析,实验数据以表示,抑制率的组间比较采用t检验。以P0.05为差异有统计学意义。 3 结果 3.1 空白鼠血清加入量选择实验结果 空白鼠血清加入量为30%时,作用3个时间段的吸光度值与10%胎牛血清组比较差异均有统计学意义;空白鼠血清加入量为10%和20%时,作用3个时间段的吸光度值与10%胎牛血清组的吸光度值相近,差异均无统计学意义。故选取培养液体积的10%和20%作为鼠血清的加入量,以使细胞能够处于正常的生长增殖状态(表1)。 3.2 含药血