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土壤真菌基因组dna提取方法优化及其多样性和代表性分析 1 土壤微生物全基因组dna提取 土壤真菌是土壤生态系统的重要成员。作为生物地球化学循环的重要参与者，它在碳、氮、磷、硫等养分循环中发挥着重要作用。同时作为土壤生态系统外源有机污染物的重要分解者之一,在环境健康等方面发挥着重要作用。由于真菌组成与结构的复杂性,到目前为止,自然土壤环境中大部分真菌尚不能人工分离培养,自然栖息环境中150万种真菌仅有5%～10%已被人类认识(Bassam Caetano-Anolles,1991;Hawksworth Rossman,1997;Hawksworth,2001)。要客观地揭示土壤中真菌群落结构组成、生态功能以及相互关系,最直接有效的方法是从土壤中提取全部微生物基因组DNA,并利用合适的分子生物学分析技术,对其中真菌组成、变化及功能进行研究(Ranjardet al.,2000;Lordet al.,2002;张汉波等,2003; Agnelliet al.,2004;de Lipthayet al.,2004; Kirket al.,2004)。因此,从土壤样品中直接提取的真菌全基因组的质量和代表性将影响到人们对土壤中真菌种群组成、结构与丰度的认识,建立适宜的土壤真菌全基因组DNA提取方法对开展土壤真菌分子生态学研究至关重要。 土壤生态系统是化学组成最为复杂的系统之一,其中许多复杂组分,尤其是腐殖质酸类物质,不仅影响提取的土壤微生物全基因组DNA质量,同时也对后续PCR扩增、杂交以及内切酶消化等均将产生负面影响。由于真菌细胞壁结构特殊,含有大量几丁质以及多糖类物质,使得土壤真菌DNA的提取比细菌难度更大。同时,不同地域土壤的理化性质有着很大差异,许多土壤基因组DNA提取方法能够为土壤的微生物生态研究提供良好基础,但在另外一些土壤中的应用却受到了限制(Zhouet al.,1996;Krsek Wellington,1999;Milleret al.,1999;Bürgmannet al.,2001; Martin-Laurentet al.,2001;Roose-Amsaleget al.,2001;Robeet al.,2003;Bertrandet al.,2005)。中国北方土壤腐殖质酸含量较高,DNA提取相对困难,因此,本实验针对真菌结构特点,在传统土壤微生物基因组DNA提取(Hurt,2001;Andersonet al.,2003;Brodieet al.,2003;Anderson Cairney,2004)和纯培养真菌DNA提取方法(Cenis,1992;李绍兰等,2002)的基础上,结合蜗牛酶、纤维素酶及溶菌酶等细胞裂解的常用酶制剂(尹睿等,2002),优化了一种适合于北方土壤真菌全基因组DNA提取的有效方法,为开展北方土壤真菌分子生态学研究奠定基础。 2 材料和方法 2.1 蘑菇的来源和培养 供试菌株见表1。所有供试菌株培养均采用PDA斜面培养基,于25 ℃培养4～5 d。 2.2 土壤样品的理化性质 分别采集中国科学院沈阳生态站、中国科学院长白山森林生态系统定位站和沈阳生态所乌兰敖都荒漠化实验站具有不同理化性质的3种土壤样品(表2)。土壤样品以叉花点式采样法采集,分别取5处表层0～20 cm土壤样品共10 kg,充分混匀,过2 mm筛后于-65 ℃保存备用。 2.3 土样的制备 供试土壤采自中国科学院海伦农业生态实验站小麦-玉米-大豆轮作地表层0～20 cm土层,称取250 g土样,121 ℃,30 min湿热灭菌。取等量斜面培养收集到的菌体(表1)于无菌匀浆器中,混匀;加入少许无菌水,匀浆;无菌条件下将匀浆液加入250 g灭菌黑土中,充分混匀后于-20 ℃保存备用。 2.4 dna的提取 分别收集少许培养皿中PDA培养基上生长的菌丝体于1.5 ml EP管中,加入0.95 ml提取缓冲液(100 mmol·L-1EDTA+100 mmol·L-1Tris+1.5 mol·L-1NaCl,pH 8.0),在旋涡混合器上振荡混匀,再加入0.05 ml 20%的SDS使终浓度为1%,65℃水浴30 min后,参考Zhou等(1996)的DNA提取方法,提取纯菌DNA,溶解于TE(10 mmol· L-1Tris+1 mmol·L-1EDTA),并于-20 ℃保存备用。 2.5 裂裂裂解 应用4种不同处理手段:1)液氮研磨;2)冻融(至-65 ℃冰箱中30 min,-65 ℃水浴30 min)3次;3)2%SDS,65 ℃裂解;4)纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶(终浓度分别为6、3和1 mg·ml-1)37 ℃裂解(王卫卫等,2002),将其进行不同组合,提取本实验中制备的投菌土样真菌全基因组DNA,并从中选