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-葡萄糖苷酶ec3221研究进展 e3。2.1.21岁。它的英文名称是“界脂鱼”，属于水解酶类。1987年，leebig和wohel首次在苦杏仁中发现，然后在自然界中发现。它可以来源于植物、微生物,也可来源于动物。它的特性是可水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基;此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。根霉能在许多种纤维素物质上生长,正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。 目前,国内外对于β-葡萄糖苷酶的研究,已经从单纯分离纯化分析其酶学性质向采用各种手段,如培养基优化或基因工程手段选育工业化生产用β-葡萄糖苷酶高产菌株及其实际应用的方向发展。谢宇,尚晓娴等研究了来源于曲霉No 5.1的β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质。粗酶液经沉淀、柱层析得到纯β-葡萄糖苷酶,SDS凝胶电泳显示一条带,测得分子量为67.5 k D。何可可,薛栋升等采用从海底淤泥中筛选得到的曲霉Aspergillus sp.菌株,进行固体发酵生产胞外纤维二糖酶,酶的比活力由10.98 U·mg-1提高到131.21 U·mg-1。纯化得到的纤维二糖酶具有明显的海洋酶耐盐和耐热特性,有更广的应用范围。瞿丽莉,朱均均等研究了固体发酵法制备β-葡萄糖苷酶及其在纤维素水解上的应用。王冰冰,夏黎明等研究了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表达,发酵试验表明,基因表达产物可以在cbh1信号肽的引导下顺利地向细胞外分泌。发酵48 h,重组菌株的纤维二糖酶活力可以高达5.3 IU·m L-1,是原始菌株的106倍。李旭晖,朱明军等建立1种测定粗纤维素酶中β-葡萄糖苷酶酶活的方法。该方法简单、快速、灵敏度高。 1 半乳糖苷酶家族 根据氨基酸序列分类,人们将β-葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1和3中。家族1中的β-葡萄糖苷酶来源于细菌、植物;家族3中的酶来自真菌、细菌和植物。家族1中的酶除有葡萄糖苷酶活性外,还有很强的半乳糖苷酶活性。 根据高级结构的相似性,糖苷酶家族可以被分成若干部族(Clan),糖苷水解酶家族1属于“clan GH-A”(superfamily4/7)。其特点是催化结构域具有(β/α)桶状结构,2个羧基氨基酸参与催化反应,作为质子供体和亲核基团,分别位于第4位和第7位的β折叠上。Moracci等通过比较11种糖苷族1的氨基酸序列,发现了-N-E-P-和-Y-l-E-N-2个保守序列,并用定点突变的方法证明了保守序列中的2个Glu分别是酸、碱基团和亲核基团。也有试验通过自杀底物共价修饰和定点突变试验证明了这种结论。 2 3-葡萄糖糖苷酶的理化性质和加速反应机制 2.1 相对分子量和ph值 β-葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分,有些生物体内只含有胞内β-葡萄糖苷酶,也有的只含胞外β-葡萄糖苷酶,但有少部分微生物体内同时含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在40~250 ku之间。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。大部分β-葡萄糖苷酶的最适p H值都在酸性范围,并且变化不大,但最适p H值可以超过7.0,而且酸碱耐受性强。β-葡萄糖苷酶的最适温度在30~110℃之间,一般来说,来自细菌的β-葡萄糖苷酶其稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的β-葡萄糖苷酶。对于工业应用来说,酶的热稳定性越高越有利,对来自嗜热性和非嗜热性β-葡萄糖苷酶的分析认为,两者在相互演化过程中的酶修饰作用并不改变酶的活性中心,也不改变其专一性,只是将酶蛋白结构作部分调整以适应高温环境。 2.2 中心也是糖苷酶的底物结构 多数β-葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸残基,其中,靠近N端的谷氨酸起酸/碱作用,另一谷氨酸起亲核试剂的作用。但Grabnitz等研究发现,来自Clostridium thermocellum的β-葡萄糖苷酶的活性部分在N端的130个氨基酸区域,该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His-Asn-Glu-Pro,存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔35~55个氨基酸的His和Glu,其中质子化态的完全保持残基His121作为质子供体与G1u166协同稳定氧碳正离子。而高度保持的C端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合,其中在该区的一些微小差异与不同β-葡萄糖苷酶的底物特异性有关。Bauer等对分别来自嗜热菌Pyrococcus furiosus和非嗜热菌Agrobacterium的β-葡萄糖苷酶进行研究发现,两种来源的酶催化反应时按同一种机制进行,即在催化糖苷键的裂解反应时都遵循双取代反应机制。其反应方程如下: 第1步是酶与底物键合成米氏复合物ES(反应速率K1和K-1)。第2步是酶一底物中间体(E-S)的形成(反应速率