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睾酮对牛眼小梁细胞mdna和蛋白表达的影响 根据流行病学研究，核电站青年：女性为1.00:1.01，其中核电站闭角形青年：女性为1.00:1.53，核电站开角形青年（poag）：女性为2.55:1.00。这种差异的存在提示POAG发病与性激素可能存在一定的关系。Agapova等发现雄激素可能与青光眼发病有重要联系。眼是性激素作用的靶器官,睾酮在POAG的发病过程中是否起到一定的作用,是本次研究的重点之一。已有研究证明组织型谷氨酰胺转移酶(tissue transglutaminase,tTG)与POAG发病密切相关。那么,雄激素的存在,是否可以通过上调tTG在小梁细胞中的表达,从而在POAG的发展过程中起作用,是本次实验的研究重点。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 新生牛眼球来自武汉市牛羊加工厂,2 h内用冰瓶运回实验室进行细胞培养。胎牛血清(Hyclone公司),DMEM+F12培养基(Gibco 公司),鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白、鼠抗人纤维连接蛋白、鼠抗人层粘连蛋白(Gibco 公司),鼠抗人tTG(美国Labvision公司),SP二抗试剂盒(福州迈新公司),睾酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司),Trizol试剂(Sigma公司),逆转录试剂盒(TOYOBO公司),引物由上海生工生物技术有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 小梁细胞的dmem培养 在超净台内剪去眼周围的筋膜组织后,将其浸泡于0.2×10-6g·L-1氧氰化汞+4000 U·mL-1庆大霉素的水溶液中30 min。D-Hanks液冲洗眼球3次后,显微镜下分离取出小梁组织切成1 mm×2 mm的碎块,均匀地贴于培养瓶的瓶底。将培养瓶在37 ℃、体积分数5%CO2恒温箱内倒置3 h后,待组织块贴壁微干后,加入体积分数20%胎牛血清DMEM培养液适量。将培养瓶放入37 ℃、体积分数5%CO2恒温箱内进行培养。小梁细胞游离出组织块后,每周换液2次。等细胞长满培养瓶瓶底时,即达到汇合后,用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后按1:2的比例进行传代培养。制作细胞爬片并行Wright染色及免疫组织化学鉴定。 1.2.2 血清anps教育 将细胞分为5组。将睾酮用无水乙醇溶解后配成浓缩液,将这5组细胞的培养液吸净并用D-hanks洗2次,加入不含血清的培养液,再分别加入18×10-3mmol·L-1、36×10-3mmol·L-1、54×10-3mmol·L-1、72×10-3mmol·L-1的睾酮,放入37 ℃、体积分数5%CO2恒温箱内培养24 h;正常对照组不加睾酮。 1.2.3 引物合成及pcr扩增 取第3代近融合的牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cells,BTMC)(每培养瓶大约1×106个细胞)采用Trizol试剂盒(美国MRC 公司产品)提取总RNA 后。采用TOYOBO公司生产的逆转录试剂盒完成逆转录反应。利用Primer 5.0 软件设计牛tTG 特异性引物并合成(上海生工生物技术有限公司合成)。tTG引物序列:上游:5’-GTTCCAGTTCGTGCCATCA-3’,下游:5’-CCCTGTCTCCTCCTTCTCG-3’,扩增后片段长度为433 bp。内参扩增引物序列:上游:5’-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’,下游:5’-GACTGCTGTCACCTTCAOCGT-3’,扩增片断长度为212 bp。取cDNA进行PCR扩增,PCR循环参数:94 ℃变性1 min,52.4 ℃退火40 s,72 ℃引物延伸1 min,循环40次。取9 μL RT-PCR产物与1 μL上样缓冲液充分混合后,点样于20 g·L-1琼脂糖凝胶中电泳20～30 min,紫外透射仪上观察并照相。用凝胶图像分析仪摄片,以内参照作为标准,对各泳道进行相对积分值的测定,半定量法比较各实验组tTG mRNA相对含量。 1.2.4 蛋白免疫的测定 收集各组培养细胞,溶于RIPA裂解液中,Ep管冰上操作,反复吹打后,置4 ℃冰箱10 min,取出于4 ℃ 12 000 r·min-1离心30 min,吸出上清液,总蛋白浓度的测定采用Bradford方法测定,BSA作为标准蛋白,设定标准蛋白浓度梯度。取等量蛋白40 μg,经SDS凝胶电泳、转膜、封闭液封闭,按照说明书比例用封闭液稀释一抗和二抗,在孵育袋中孵育一抗4 ℃过夜,取出用TBST洗膜3次,每次5 min,再在孵育袋中孵育二抗,37 ℃ 1.5 h。ECL发光法显色:将ECL化学发光试剂盒中A、B两种液体按照1:1混合,淋于NC膜上,在暗室内可见蛋白质条带发出绿色荧光,曝光于Kodak底片上,洗片。扫描结果以美国Kodak dslD系统进行半定量分析。 1.3 统计分析 使用S