脂肪源性干细胞分离培养方法的比较.docxVIP

脂肪源性干细胞分离培养方法的比较 脂肪源性干（absec）是脂肪组织中存在的一种中间充质干（msec），占脂肪组织的10%20%。自Zuk等［１］从人抽吸的脂肪组织中成功分离出ADSCs以来,采用胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、透明质酸酶等酶类消化,已经建立了多种ADSCs的分离培养方法,但不同实验室采用不同的分离培养方法获得的干细胞数量、免疫表型、功能等存在一定的差异［２］,难以有效地多中心对照研究ADSCs的治疗潜能;分离用的酶类价格昂贵,且多来源于动物或细菌,易对临床应用造成病毒污染或免疫反应;而且这些分离方法耗费时间［３－４］。故建立高效、稳定可靠的、适合临床应用的ADSCs分离培养方法,将推动ADSCs的深入研究和临床治疗的广泛应用［５－７］。因此,本研究在以往分离培养ADSCs方法的基础上,探索无酶分离方法从脂肪抽吸术抽吸的人脂肪组织中分离培养ADSCs,并鉴定分析分离培养细胞的形态、增殖能力、免疫表型、分化潜能等方面指标,为下一步研究与临床应用奠定基础。 1 ad-scs的分离和鉴定 1.1 一般资料人脂肪组织来源于临床进行脂肪抽吸术的患者腹部皮下组织,共14例,其中男3例,女11例,年龄(44.0±11.6)岁,均签署知情同意书。本实验经中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所伦理委员会批准。 1.2 方法 1.2.1 ADSCs的分离培养方法(1)将收集的人脂肪组织100~300mL置于500mL的玻璃瓶,加入50mL磷酸盐缓冲液(PBS),拧紧瓶盖,用手剧烈震荡2~4 min;室温静置约5min使液体与脂肪组织分离,收集瓶底的液体至50mL于离心管内;将漂浮的脂肪组织重复以上步骤漂洗2~4次,收集下层的液体,1 200r/min室温离心10min,收集沉淀。(2)加入2mL氯化铵红细胞裂解液于沉淀组织中,轻轻吹打混匀,裂解1~2min,加入15~20mL PBS混匀,2 000r/min离心5min,弃红色上清液。(3)细胞沉淀用PBS洗涤2 次,按5.0×10４个/cm２的密度接种于50mL培养瓶中,加入含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 培养基,置于37 ℃、饱和湿度的5%CO２培养箱内培养。(4)培养24h后全量换液,弃未贴壁细胞,以后根据细胞生长情况,每3天换液1次,待细胞达到80%融合时用0.025%胰酶/乙二胺四乙酸消化传代,隔天换液;倒置相差显微镜观察记录培养细胞生长情况。同时利用0.1% 胶原酶消化法分离培养ADSCs作为对照,按照以往研究的AD-SCs分离方法进行操作。 1.2.2 ADSCs生物学特性检测(1)增殖能力:将第3 代ADSCs,以细胞计数法绘制细胞的生长曲线。根据公式计算细胞倍增时间:Td=t×[lg2/(lgNｔ-lgN０)],其中Td代表细胞倍增时间,t代表培养时间,N０、Nｔ分别代表接种后及培养t小时后的细胞数,计算平均值得到细胞倍增时间。(2)免疫表型特征:取第4 代脂肪组织分离细胞,利用流式细胞分析仪(FCM)检测细胞CD90、CD73、CD14、CD105、CD45等的表达。(3)分离细胞胚层来源:将分离培养的细胞用 α-平滑肌动蛋白(α-SMA)抗体和波形蛋白(VIM)抗体进行免疫荧光染色,采用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察。 1.2.3 ADSCs的多向分化潜能鉴定 1.2.3.1 向脂肪细胞诱导分化(1)以5.00×10４个/mL密度将第3代ADSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。(2)细胞达到80% 融合后,加入成脂条件培养基(含1μmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.50mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10%FBS的高糖DMEM培养基)2mL,置培养箱中培养。(3)隔天换液1 次,共诱导28d,对照组加入含10% FBS的低糖DMEM培养液培养。(4)诱导28d后应用油红O染色法检测脂滴形成。 1.2.3.2 向成骨细胞诱导分化(1)方法同1.2.3.1 中的(1)。(2)细胞达到80% 融合后,加入成骨条件培养基(含1μmol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基)2mL,置培养箱中培养。(3)方法同1.2.3.1中的(3)。(4)诱导28d后应用茜素红染色法检测钙沉积。 1.2.3.3 向成软骨诱导分化(1)将消化下来的ADSCs用非完全成软骨诱导培养基2 000r/min离心5min,漂洗1次,吸弃上清液。(2)用非完全成软骨诱导培养基按照7.50×10５个/mL重悬,用2 000r/min离心5min,漂洗1次,吸弃上清液。(3)将转化生长因子(transforming