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宝大蒜气生鳞茎快繁技术研究 大蒜是百合科的一种杏仁科。在中国种植了2000多年，并在全国范围内种植。大蒜以鳞茎 (地蒜) 、蒜薹和幼株食用, 还可以生产青蒜和蒜黄, 是群众最喜爱的主要蔬菜之一。宝坻大蒜“六瓣红”是津沽名优特产之一, 营养价值高, 具有强力杀菌、防治癌症、排毒清肠、降低血糖和防治心脑血管疾病等功效。但是大蒜通常以蒜瓣进行无性繁殖, 在长期的无性繁殖过程中, 因病毒逐年积累并代代相传, 使种性逐渐退化, 蒜头变小, 产量、品质大幅下降。大蒜采用气生鳞茎 (天蒜) 繁殖时, 天蒜采自蒜薹 (花薹) 顶端的花苞 (生长点) , 而大蒜生长点部位一般不带病毒, 因而可自然脱毒。 目前已建立了以茎尖、根尖、全展叶、贮藏叶、茎盘切块和花原始体等为外植体的大蒜组织培养再生体系。大蒜的离体再生途径主要有愈伤组织途径和不定芽途径。愈伤组织途径是通过外植体的脱分化实现的, 但是愈伤组织再生途径的效率不高, 因此建立一种新的高效的大蒜快繁体系是非常必要的。大蒜气生鳞茎在生产实践上主要被用来提纯及复壮, 但由于只有成熟的气生鳞茎才能做“种子”, 而培养成熟的气生鳞茎会争夺地蒜的营养, 影响地蒜的产量, 降低种蒜的收益。该研究利用未成熟的大蒜气生鳞茎作为外植体直接诱导试管苗, 使大蒜实现天然脱毒的同时, 又避免愈伤组织途径脱分化、再分化、繁殖系数低以及容易产生遗传变异的缺憾, 同时不影响地蒜的正常生长, 以期为宝坻大蒜的脱毒快繁和种质创新打下基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 供试材料为宝坻大蒜“六瓣红”的气生鳞茎。 1.2 测试方法 1.2.1 气生嘴唇形态观察 选取3个花苞, 按体积的大小从中挑取10颗气生鳞茎进行排序, 分别称量并记录气生鳞茎重量, 并进行形态学解剖, 观察其是否含有贮藏叶。统计重量为何值时气生鳞茎中不再含有贮藏叶。因为只有含有贮藏叶, 气生鳞茎才有可能诱导生成试管苗。3次重复。 1.2.2 培养基的制备 以MS培养基为基本培养基, 添加不同种类和浓度的激素, pH 5.8;高温高压灭菌20min;待冷却至60℃时, 分装到200mL的组培瓶中, 每瓶约35mL, 盖紧瓶盖备用。试验中所用培养基为:试管苗诱导培养基:MS基础培养基+1.0mg/L NAA+5.0mg/L KT;试管苗生根培养基:MS基础培养基。 1.2.3 大蒜气生英镑的低温处理 在不影响地蒜生长的前提下将尚未成熟的花苞采摘下来, 4℃保存, 共设置低温7、14、28、84d4个处理, 用于试管苗诱导试验。 1.2.4 试苗诱导处理 取生长良好有贮藏叶的宝坻大蒜气生鳞茎, 用75%的乙醇浸泡10min, 用无菌水冲洗, 滤纸吸干, 再用0.1%的HgCl2灭菌10min, 用无菌水冲洗3次, 滤纸吸干, 接入试管苗诱导培养基上, 每瓶接入7颗气生鳞茎, 每个处理20瓶, 按1.2.3下的方法低温处理。培养条件为日温25℃, 夜温20℃, 光照1 500lx, 光照时间14h/d。培养49d, 每7d进行观察统计诱导率。 1.2.5 生根培养 将诱导出来的生长旺盛的苗转入生根培养基中, 诱导生根, 生根培养基为MS基础培养基。35d之后统计生根率。 1.2.6 壮苗和小植株的移栽和栽植 生根后的试管苗, 待其长到3片真叶、生根3~4条时, 室温开瓶练苗, 7~10d后将小植株从试管中取出, 洗去根部培养基将其移栽至灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土 (1∶3∶6) 中, 移栽后保持日温25℃, 夜温15℃, 在组织培养室中放置30d壮苗, 之后移栽到大田。 1.2.7 卡诺固定液 待地蒜根 (对照) 和气生鳞茎诱导的试管苗的根长到1cm时将根取下, 用卡诺固定液固定24h, 于70%乙醇中保存, 用于染色体观察。将根在1mol/L盐酸、60℃条件下解离8min, 蒸馏水冲洗3遍, 用滤纸将处理好的根擦干, 取根尖, 用卡宝品红染色8min, 压片, 进行染色体的观察。 2 结果与分析 2.1 气生茎重量对作酒精度的预测 气生鳞茎是否含有贮藏叶是其能否发芽的关键, 只有含有贮藏叶的气生鳞茎才有可能被诱导生成试管苗, 所以, 在气生鳞茎诱导培养之前, 对不同大小的气生鳞茎做形态学解剖, 找出气生鳞茎的重量与是否含有贮藏叶之间的关联, 最终通过称重挑选带有贮藏叶的气生鳞茎进行试管苗诱导。从表1可以看出, 在第1组中重量为0.0093g的气生鳞茎含有贮藏叶, 重量为0.0076g的气生鳞茎不含有贮藏叶, 第2组中重量为0.0089g的含有贮藏叶, 重量为0.0078g的不含有贮藏叶, 在第3组中重量为0.0088g的含有贮藏叶, 重量为0.0082g不含有贮藏叶。3次试验中不含贮藏叶的气生鳞茎重量的平均值为0.009g, 所以, 选取重量大于0.009g的气