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中国对虾人工授精方法的建立 在对日本虾加工方法的研究中，许多研究是精细移植和对室外虾加工的研究。Persyn最早研究成功对虾精荚移植方法,他用手挤压雄性对虾第5对步足基部的精荚囊,将挤出的精荚粘贴在雄性对虾腹部,该方法应用于具开放式纳精囊的对虾类。Sandifer等采用相同的方法对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)进行了人工授精,并在1980年研究使用电刺激法获取精荚并获得成功。此后Muthu等和Lin等将人工精荚移植技术应用到斑节对虾(Penaeus monodon)也获得了成功。杨丛海等应用改进的电刺激装置采集中国对虾雄虾的精荚,并进行了人工授精实验。在体外人工授精方面,Clark等以褐对虾(Penaeus aztecus)为实验材料,将解剖的卵子和精子混合,首次获得了虾类体外人工授精的成功,但受精率仅10% ,且重复性较差。Lin等研究过斑节对虾的人工体外授精,选用未交尾的雌虾,在雌虾产卵前后的不同时刻,将精液加到不同容积的产卵池中,分别 获 得 了 63.11%,52.29%和49.44%的孵化率。孔杰等和包振民等也就中国对虾的体外人工授精技术方法进行过研究。 虽然精荚移植技术已经成功用于中国对虾的人工繁殖,但在建立家系进行中国对虾选择育种方面,精荚移植法建立半同胞家系的数量和成功率都有一定限度,不能很好满足中国对虾选择育种所需建立的全同胞和半同胞家系数量,家系数量不足会影响到遗传参数估算的准确性,以及对每个世代留种个体的育种值和选择指数造成偏差。而体外人工授精需要杀死雌虾或静候母体产卵,十分费时费力,在生产实践中应用受到限制。因此,需要改进或尝试建立新的人工授精技术来建立足够的全同胞和半同胞家系,以保证各种参数的准确性和育种工作的顺利进行。 本实验应用完整精荚移植和输精管移植,并尝试精荚切块移植和精液移植进行中国对虾的人工授精,对比了4种方法的授精成功率、受精率和幼体的孵化率,最终获得了101个全同胞家系,和29个半同胞家系,为以后的选择育种工作打下了坚实基础。 1 材料和方法 1.1 越冬亲虾的选择 实验在黄海水产研究所鳌山卫实验基地进行,材料采用未交尾的越冬亲虾:乳山湾海捕中国对虾、青岛近海海捕中国对虾和朝鲜群体养殖二代中国对虾,以及黄海所鳌山卫实验基地的养殖亲虾。 1.2 精荚移植的方法 2005年3月24-25日,采用4种人工授精方法,对未交尾雌虾进行人工授精。 完整精荚移植法:取雄虾、雌虾各1尾,用酒精棉球擦拭体表。用手挤压雄虾第五对步足基部的精荚壶腹部,挤出精荚,小心地剥去精荚囊,剪去瓣状体,用镊子夹住瓣状体基部,将整个精荚放入撑开的未交尾雌虾纳精囊中。 输精管移植法:将输精管中端部分取出,所取输精管长短要根据雌虾纳精囊的大小进行调整,一般0.5~1.5 cm左右,移植到雌虾纳精囊中。 精荚切块移植法:将精荚切块,一个精荚可以切成2~3块,然后分别移植到几尾雌虾的纳精囊中。 精液移植法:取已交尾的雌虾,用酒精棉球擦拭体表,特别是纳精囊部位,然后用手挤压纳精囊,使精子团露出,用消毒过的注射针头蘸取适量精液,根据精液量的多少分成多份,分别移植到未交尾雌虾纳精囊中。一般1尾雌虾纳精囊中的精液可以移植到2~4尾雌虾中。 1.3 亲虾的授精成功率 将人工授精后的亲虾每尾单独置于室内2.8 m3(2 m×1 m×1.4 m)的方缸中,将水温控制在14 ℃,促其产卵。实验用水为沙滤水,盐度25~29,pH 8.2~8.6。 亲虾产卵后,根据是否出现受精卵,采用授精成功率指标来衡量4种移植方法各自的授精成功情况。授精成功率为该移植方法中出现受精卵的亲虾数与采用该方法总共移植的亲虾数的比值。 每天观察产卵情况,在亲虾产卵后,随机收集200粒卵在显微镜下观察,统计受精率。受精率为受精卵数与所收集卵子的总数之比,以出现受精膜和能进行正常细胞分裂为指标。 产卵后将亲虾捞出,将水温缓慢升至16~18 ℃,进行幼体孵化,并计算变成无节幼体时的孵化率。孵化率为无节幼体数量与受精卵数量的比值。 1.4 处理数据 应用SPSS分析软件对4种方法获得的平均受精率和平均孵化率进行单因素方差分析(ANOVA),比较其差异显著性。 2 结果与分析 2.14 不同人工体外授精方法获得的成功率比较 4种人工授精方法移植的亲虾数、授精成功的亲虾数及授精成功率见表1。从表1可以看出,4种人工体外授精方法均获得了较高的授精成功率,都在50%以上。其中,完整精荚移植的授精成功率最高,为80.8%,输精管移植的授精成功率最低,为53.3%。 2.24 采用人工精测法的显著性统计 对出现受精的卵进行受精率统计,每种方法的平均受精率见表1。从表1可以看出,4种人工体外授精方法均获得了较高的平均受精率。 2.34 幼被孵化的培养情况 对