分子生物学实验操作表达载体构建.docxVIP

原核体现 1.SHMT1基因的登陆号是At4g37930，请你根据这个登陆号在基因库里查找该基因编码区的序列，设计添加酶切位点的特异引物，通过PCR扩增出来，再亚克隆到T载体中，然后用pET28a构建SHMT1基因的原核体现载体，体现SHMT1基因编码的重组蛋白，预测重组蛋白的分子量，并用亲和层析纯化重组蛋白，请用图解的方式写出你的实验方案。 酶切位点： BamHI (GGATTC) XhoI(CTCGAG) Sequence (5-3) Length Tm GC% Forward primerGGATTCCCAGAGATAGAGAGAGGTTTAGCG 24 59.78 50.00 Reverse primerCTCGAGACACTTGTGGGGTGAAACAG 20 58.24 50.00 （注: 如果PCR产物连接T载体再酶切，就没有必要加保护碱基；如果是PCR产物回收后直接酶切，还是加上保护碱基的好（由于保护碱基对内切酶切割DNA有很大影响） 保护碱基普通都加在5‘端，如果两端都加的话，将造成目的基因上引入若干个碱基序列，如果是基因体现实验的话，有可能造成下游基因移码突变。) 8. SHMT1基因PCR扩增和亚克隆到T载体（TA克隆） 9.载体转化到感受态细胞 10.阳性克隆检测 PCR检测;限制性酶切分析；菌液测序 11. pET28a构建SHMT1基因的原核体现载体 12. SHMT1在大肠杆菌中的体现与纯化 13.重组蛋白的分子量预测 2.请根据MS基因登陆号NM_120467在基因库里查找该基因编码区的序列，设计添加酶切位点的特异引物，通过PCR扩增出来，再亚克隆到T载体中，然后用pGEX-4T-1 构建MS基因的原核体现载体，体现MS基因编码的重组蛋白，预测重组蛋白的分子量，并用亲和层析纯化重组蛋白，请用图解的方式写出你的实验方案。 酶切位点： SmaI ccc|ggg NotI gc|ggccgc Sequence (5-3) Length Tm GC% Forward primer 5 CCCGGGCACATGTCAATGCGTTTCACCGATT 3 21 52.6 38.1 Reverse primer 5 GCGGCCGCTCTTCTTTCTTTCAGAGCCT 3 20 51.1 40 Product length 1793 8.载体转化到感受态细胞 9. 阳性克隆检测 PCR检测;限制性酶切分析；菌液测序 10. pGEX-4T-1构建MS基因的原核体现载体 11. MS在大肠杆菌中的体现与纯化 酵母体现载体技术有关作业 1、根据文献报道推测烟草中14-3-3c蛋白和MDH蛋白可能有互相作用，下列给出这两个蛋白编码区的序列，请你设计引物扩增这两个基因的编码区序列，TA克隆测序确认无误后亚克隆于酵母双杂交载体中，转化酵母菌在酵母系统中进一步验证这两种蛋白的互相作用，请用图解的方式描述你的实验方案。 植物体现载体 根据文献报道推测烟草中14-3-3c蛋白和MDH蛋白可能有互相作用，下列给出这两个蛋白编码区的序列，请你设计引物扩增这两个基因的编码区序列，TA克隆测序确认无误，然后构建这两个基因的过体现载体，通过农杆菌介导的办法转化烟草获得转基因植物，再检测转基因的插入和转录水平。并通过两种技术验证这两种蛋白的互相作用，请用图解的方式描述你的实验方案。 1核小体（nucleosome）：核小体是由DNA和组蛋白形成的染色质基本构造单位。每个核小体由147bp的DNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体核心颗粒之间通过60bp左右的连接DNA相连。 染色质就是由一连串的核小体所构成。上面有H1（H5）、H2A、H2B、H3和H4组蛋白。 2端粒 ( Telomeres)：是存在于 真核细胞线状 染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”构造，作用是保持染色体的完整性和控制 细胞分裂周期。 3 CpG 岛 ( CpG island): 哺乳动物DNA中5’—CG—3’序列普通在胞嘧啶碱基处被甲基化，它与染色质中的非转录区相连。基因组中尚有未甲基化的CpG“岛”，包围着持家基因的启动子区域。 4中心法则（genetic central dogma）：是指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译的过程,以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程. 5原癌基因（proto-oncogene）：是细