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3种活血法对cag癌前病变大鼠早期细胞凋亡的影响 慢性基底性胃炎（cag）是胃肠疾病和疑难病之一。以cag为基础的肠皮肤感染和异型增生是早期胃癌疾病的特征。临床上中医药运用活血化瘀法治疗本病取得了较好的效果。本研究复制大鼠CAG癌前病变模型,以研究益气活血法、活血化瘀法和理气活血法对萎缩性胃炎癌前病变大鼠早期细胞凋亡的影响。 1 材料表面 1.1 实验动物概况 雄性Wistar大鼠,体重180～220 g,清洁级,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物许可证编号:SCXX(京)2002-0003。大鼠在相同条件下分笼饲养,每笼5只,常规喂养标准颗粒饲料,自由饮用水。 1.2 中药浸膏组 实验用药三七粉、黄芪、香附由北京中医药大学东方医院药剂科代购,其中黄芪、香附由东方医院制剂室制成中药浸膏。以上药物实验时均用双蒸水配制成合适浓度备用。 1.3 日本仪器实验室 膜联蛋白(Annexin V)-FITC试剂盒(美国BD公司) ,碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司),Rnase A(美国Sigma公司)。北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室II级动物实验室,许可证号:SYXK 11-00-0029。 TP-1000 电子天平,湘仪天平仪器厂;OLYMPUS B×51 显微镜,日本制造;LEIKA RM2135 石蜡切片机,LEIKA ASP300 脱水机,德国制造;流式细胞仪:FACScalibur,美国BD公司制造。 2 方法 2.1 金属弹簧前插装法 按文献的方法,将雄性Wistar大鼠禁食不禁水16 h后,以1.0%戊巴比妥5 mL/kg腹腔注射麻醉,称重,固定大鼠四肢,在无菌条件下开腹,暴露胃,在胃前壁距幽门环0.2 cm无或少血管处切一小口,将一长约2 cm、直径约0.2～0.3 cm的金属弹簧前1/3插过幽门环进入十二指肠,用缝线将弹簧两端及中央固定,按手术常规逐层缝合胃及腹壁切口。手术后禁食不禁水24 h,恢复性饲养1周后,开始灌胃60～70 ℃高盐热淀粉糊(含15%NaCl),每次2 mL/只,2次/周,连续24周。并于造模结束前随机抽取模型组大鼠8只进行胃黏膜病理形态学检查,其中7只出现轻、中度不典型增生,确认造模成功。 2.2 灌胃时间及次数 造模结束后,将模型大鼠用拉丁表法随机分为活血化瘀组、理气活血治疗组、益气活血和自然恢复组,每组8只大鼠,各组分别灌胃0.7 g/kg三七粉、0.7 g/kg三七粉加2.33 g/kg香附浸膏、0.7 g/kg三七粉加3.5 g/kg黄芪浸膏、生理盐水,每天上午灌胃1次,连续12周,于给药第12周末处死大鼠。另设空白对照组,8只大鼠,常规饲养,未经任何特殊处理。 2.3 注意一般情况 观察动物外观变化、活动情况,每周称体重1次,实验结束后比较各组大鼠体重的变化。 2.4 流式细胞培养检测 2.4.1 分离细胞悬液制备 各组大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后,剖腹取胃,漂洗干净后,于胃窦部取米粒大小组织,剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小,用组织匀浆器研磨成细胞悬液,过200目筛网,取滤液离心1 000 r/min,用PBS洗2遍,再过300目筛网,所得滤液即为单细胞悬液。显微镜下细胞计数,调整细胞浓度2×109L-1,备用。 2.4.2 分离人细胞,制备ndb基因,增加表达,扩大流式细胞 严格按说明书进行操作:取1×106细胞用冷的PBS洗2次,悬浮于100 μL binding buffer,加入5 μL Annexin V- FITC及5 μL PI,混匀后室温避光染色15 min,加入400 μL binding buffer,1 h内用流式细胞仪获取细胞并分析结果。 2.4.3 nv-fici/pi双标记流式细胞术检测细胞亚群 光源为488 nm氩离子激光器,FITC受激发后发绿色荧光,PI发红色荧光,以CELLQuest软件获取10 000个细胞并分析凋亡百分比。Annexin V- FITC/PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常细胞、机械损伤细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开。以Annexin V- FITC和PI荧光作双参数散点图,可见细胞分为4个亚群:A:Annexin V-FITC(-)、PI(-),代表正常细胞;B:Annexin V- FITC(-)、PI(+)代表机械损伤细胞;C:Annexin V-FITC(+)、PI(-),为早期凋亡细胞;D:Annexin V-FITC(+)、PI(+)为坏死细胞。 2.5 统计方法 计量资料用均数±标准差表示,用单因素方差分析方法统计。 3 结果 3.1 两组体重对比 中药灌胃12周后处死大鼠,自然恢复组体重(601.25±41.16) g,显著低于空白对照组体重(661.00±37.29)