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食线虫真菌的侵染性胞外水解酶研究进展 蠕虫是一个线性的多细胞原生动物，广泛分布于海水、淡水和土壤中，其中一些可以寄生在植物和动物身上。植物寄生线虫可以引起多种经济作物的严重病害,造成巨大的经济损失。其中危害最严重的线虫包括根结线虫(Meloidogyne spp.)、胞囊线虫(Heterodera spp.)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)等。应用化学农药虽然对病原线虫有良好的防治效果,但是化学农药容易造成环境污染、农药残留和线虫容易产生药物抗性等缺点,所以,研究杀线虫生物资源和开发生物杀线虫制剂日益受到关注。 食线虫真菌是指寄生、捕捉、定殖和毒害线虫的一类微生物,它们在植物的病原昆虫和线虫的生物防治中起着非常重要的作用。依据它们侵害线虫的习性可以把它们分为捕食真菌(trapping fungi)、内寄生真菌(endoparasitic fungi)、机会真菌(opportunistic fungi)和产毒真菌 (toxic fungi)四大类群。其中寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporium)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)等食线虫真菌在侵染线虫的过程中能够分泌胞外酶并参与对线虫体壁的降解和侵染过程。四个类群及其侵染方式只是相对而言,比如:白色单顶孢(Monacrosporium candidum)既可产生粘性球,又可产生非收缩环;淡紫拟青霉既可以定殖于线虫的孢囊、寄生雌虫、卵,又可产生有毒物质。 对食线虫真菌的研究表明蛋白酶等侵染性胞外酶在侵染线虫的过程中起着非常重要的作用,然而,这些食线虫真菌在自然条件下所产生和分泌的胞外酶的浓度是非常低的 (1～2 μg/L), 所以提高食线虫真菌的胞外蛋白酶的表达水平是提高线虫生防制剂防效的关键。?hman等的研究工作表明应用分子生物学手段构建的含有多拷贝胞外蛋白酶(PII)编码基因的突变株不仅能够使生防菌株分泌更多的胞外酶,而且生防菌株的捕食能力也得到了极大的增强,这也为食线虫真菌的遗传改造提供了较好的思路和方法。本文综述了目前食线虫真菌侵染性胞外酶的研究进展,同时对面临的一些问题进行了探讨。 1 寡孢节丛孢pii基因的诱导表达 捕食线虫真菌是一类营养菌丝特化形成捕食器官(Predacious devices)捕捉线虫的真菌,迄今报道的有12个属,其中研究和应用比较广泛的有节丛孢属(Arthrobotrys)、单顶孢属(Monacrosporium)和隔指孢属(Dactylella),这3个属的亲缘关系比较接近,根据我们对其中的一些菌株的初步研究结果,它们在侵染过程中都能够产生生化性质相近的具有降解线虫体壁的胞外丝氨酸蛋白酶。 寡孢节丛孢是目前所研究的分子背景了解最清楚的捕食线虫真菌,它对线虫的侵染包括以下的生物学过程:首先是用三维菌网捕捉线虫,菌丝黏附于线虫的体表;接着菌丝分泌胞外酶降解线虫的体壁,并穿透线虫的体壁;最后消解线虫的体内组织并杀死线虫。Tunlid等从寡孢节丛孢发酵液中纯化了一种胞外丝氨酸蛋白酶PII,它不仅能够固定全齿复活线虫(Panagrellus redivius),而且能够降解线虫的体壁。?hman等克隆得到PII的编码基因,随后又构建了含有多拷贝PII基因的突变株和PII基因缺失的突变株,检测结果表明PII基因的多拷贝突变株能够产生更多的捕食器官并且具有更快的捕食速度和杀死线虫的能力,这是通过分子生物学手段提高捕食线虫真菌捕食能力的首次报道;然而PII缺失的突变菌株的致病性并没有受到明显的影响,这表明在寡孢节丛孢中除了丝氨酸蛋白酶以外还有其它的毒力因子参与对线虫的侵染过程。 Zhao等也丛寡孢节丛孢中分离了一种和PII生化性质相似的胞外中性丝氨酸蛋白酶Aoz1,它的编码cDNA序列和PII的编码基因同源性高达97%,氨基酸序列同源性为93%,由此推测Aoz1和PII很可能是具有相同功能的同功酶。 Schenck 等检测了8种捕食线虫真菌产生胶原蛋白酶的能力,发现所有的测试菌株都能产生胶原蛋白酶,并且生长快的菌株酶活性也相对较高。Tosi 等在Arthrobotrys tortor的南极分离株中也检测到胶原蛋白酶活性,他的研究结果表明这些捕食线虫真菌产生的胶原蛋白酶是一种组成型胞外丝氨酸蛋白酶并参与对线虫的侵染。 尽管对寡孢节丛孢的胞外丝氨酸蛋白酶的分泌和线虫的侵染过程的相关性已经得到深入的研究,但对其它捕食线虫真菌的胞外酶分泌尤其是分子机理方面的研究报道比较少。我们实验室自2000年以来对食线虫真菌分泌的与侵染相关的胞外酶及相关基因做了较系统的研究工作,从圆锥节丛胞(Arthrobotrys conoides