基于r-pcr的登革热1-4型病毒保守区rna片段的制备.docxVIP

基于r-pcr的登革热1-4型病毒保守区rna片段的制备 热梨花是由热病毒引起的急性皮疹。它在中国东南沿海地区广泛流行。它容易在大规模动员和难民浪潮时发病率和繁荣。登革热病毒还是重要的生物战剂, 有4种不同的血清型, 即DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4。登革热临床症状与许多病毒性、细菌性和寄生虫感染疾病在临床上难以区别, 以核酸扩增为基础的登革热快速侦检技术具有重大的军事和社会意义。 本研究克隆了登革热1-4型病毒的部分型特异性基因序列, 分别构建至PGEM-T-easy载体, 进行体外转录, 获得了定量拷贝数的含目的基因序列的RNA转录体, 可为登革热病毒的核酸快速检测方法的建立和改进提供准确可靠的阳性定量标准品。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 微生物检测中心 登革热1-4型病毒培养液由军事医学科学院五所微生物检测中心提供。菌种XL10-gold购自美国Stratagene公司, pGEM-T easy载体购自美国Promega公司。 1.1.2 酶及dna连接酶、dna制备及rt-pcr试剂盒 病毒RNA提取试剂盒 (德国QIAGEN 公司) ;Pyrobest Taq DNA聚合酶、Nde I内切酶及DNA连接酶、DNAMarker DL2000、DNA纯化及片段回收、抽提质粒、RNA转录纯化试剂盒为TaKaRa公司 (中国大连) 产品。SuperScript III一步法RT-PCR试剂盒 (美国Invitrogen公司) ;Riboprobe System-T7体外转录试剂盒 (美国Promega 公司) 。 1.2 方法 1.2.1 den-3引物的设计 根据DEN-1 (GenBank登录号AF513110) 、DEN-2 (GenBank登录号AF489932) 、DEN-3 (GenBank登录号AY099336) 和DEN-4 (GenBank登录号AF326573) 基因序列, 设计扩增各型登革热病毒保守区基因的引物, 其中Den-0为通用上游引物, DEN-P1～DEN-P4各为DEN-1至DEN-4的下游引物。由Takara (大连) 公司合成 (表1) 。 1.2.2 病毒资源提取 采用QIAGEN试剂盒并按说明书操作提取。 1.2.3 tinumtaq健康 采用Invitrogen一步法试剂盒, 反应体系如下:2×Reaction Mix 25 μl, Platinum Taq Mix 2 μl, RNA模板5 μl, 上下游引物 (50 pmol) 各1 μl, DEPC水补至50 μl。反应条件为:50 ℃反转录30 min;94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s、68 ℃延伸100 s, 循环40次;最后再以68 ℃延伸5 min。 1.2.4 别与pgem-t-tpge-制备法 在T4 DNA连接酶作用下, 纯化的PCR产物分别与PGEM-T easy载体于20 ℃反应1 h后, 4 ℃连接过夜。用CaCl2法制备感受态细胞, 将连接产物转化至XL 10-gold细胞中。 1.2.5 质粒的提取 使用蓝白斑试验筛选重组质粒, 挑取白色菌落转接至含氨苄青霉素100 μg/ml 的LB 培养液中, 37 ℃, 230 r/min培养过夜, 提取质粒DNA。以质粒为模板, 利用表1引物进行PCR 扩增, 检查插入片段的大小, 根据目的片段大小来判定其阳性, 送交上海捷瑞生物公司进行双向测序。 1.2.6 对优质粒载的线性处理和浓度测定 质粒用NdeⅠ内切酶经37 ℃消化2 h, 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物, 观察线性化结果。 1.2.7 转录产物的纯化 利用Riboprobe System-T7试剂盒, 室温配制20 μl反应体系:5×Buffer 4 μl, DTT (100 mmol/L) 2 μl, RNasin (40 U) 1 μl, rNTP (终浓度各为0.5 mmol/L) 5 μl, 线性化质粒 (0.3 μg/μl) 2 μl, T7 poly (18 U) 1 μl, DEPC H2O 5.5 μl。反应条件为37.0 ℃ 1 h。转录产物加Dnase (1 U/μl) 1.5 μl继续反应20 min除去DNA模板, 用RNA转录纯化试剂盒进行纯化并用NanoDrop ND 1000分光光度计定量。转录产物浓度可以换算为拷贝/μl。拷贝数= 浓度×阿伏加德罗常数/ (1个碱基对的平均分子质量×总长度) , 阿伏加德罗常数为6.02 ×1023。用DEPC水将其分别依次梯度稀释。取各稀释液作模板, 进行RT-PCR, 引物和扩增条件与前述步骤相同。 2 结果 2.1 en-4基因片段扩增 由图1可知 D