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推拿对大鼠远端结肠c-el表达的影响 长期卧床患者经常便秘，骨折综合征患者也经常便秘。根据上述观察，建立了大便模型。推拿是治疗便秘的有效方法, 但治疗机制研究报道较少。Cajal细胞在胃肠运动中的重要作用已被证实, Cajal细胞的数目和功能的改变将引起胃肠蠕动的异常, c-kit是卡哈耳氏细胞的标记物, 运用免疫印迹方法检测大鼠结肠远端c-kit蛋白的表达, 来揭示Cajal细胞数目的改变, 从而阐明推拿治疗便秘的机制。 1 材料和机器 1.1 对比两组年龄模式 上海斯莱克实验动物有限公司提供10周龄、18周龄雄性SD大鼠各32只, 随机分成8组即高龄 (18周) 正常对照组8只、高龄模型对照组8只、乳果糖治疗组8只、推拿干预组8只;低龄 (10周) 正常对照组10只、低龄模型对照组8只、乳果糖治疗组8只、推拿干预组8只。除正常对照组外, 其他各组均剪除双后肢股骨1.0 cm, 单笼饲养8周后, 开始治疗, 2个月检测各项指标。 1.2 仪器和试剂 1.2.1 仪器 高速离心机、分光光度仪、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 1.2.2 考察检吸液、受试液、c-乱世兔的多抗 单去污剂裂解液、10%分离胶、4%浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、10X丽春红染液、封闭液、显影液、定影液、c-kit (sc-168) 兔多抗购于santa cruz公司。 2 治疗双侧股骨 2.1 造模方法 具体操作如下:SD-大鼠用20%乌拉坦, 按0.4 ml/100 g体重给药, 腹腔注射麻醉后, 仰卧固定于木板上, 75%酒精消毒下肢内侧及腹部皮毛, 从膝关节向上剪除大腿内侧1 cm×2 cm大小被毛, 再用安尔碘消毒局部皮肤, 从膝关节向上剪开2 cm皮肤, 用11号刀片挑开鼠膝关节, 先向下分离股骨下端附着的韧带肌腱, 将股骨远端从膝关节中分离出来, 此处操作应小心, 否则会引起血管损伤而出血, 提起股骨远端向上剥离骨膜1 cm, 用18 cm弯骨剪在股骨四周剪切一圈, 不可用力过大, 否则会剪碎股骨, 断端不齐术后有刺破大血管的风险, 剪掉股骨下端1 cm后, 分别缝合肌肉、皮下组织和皮肤, 手术完毕, 单笼饲养。模型剪单腿组剪除单侧股骨;模型剪双腿组剪除双侧股骨。 2.2 干预方法 推拿干预组用QGAWA-PM30电动按摩进行电动按摩, 取足三里、天枢、中脘、关元穴, 2次/d, 每穴3 min, 持续治疗8周;乳果糖组采用乳果糖稀释液灌胃作疗效对照。 2.3 Western blot方法 2.3.1 电泳 从各蛋白样品中取等量蛋白 (50 μg) 与1×SDS凝胶上样缓冲液混合, 定容到相同体积, 加入1 μl的β-ME (β-Mercaptoethenal) , 一起煮沸。在4℃下, 12 000 r/min, 离心5 min。 蛋白上样, 经由12%SDS分离胶分离, 浓缩胶50 v, 40 min; 分离胶 100 v电泳到溴酚蓝至底边1/3处。 2.3.2 转膜 PVDF膜用甲醇浸湿, 去离子水冲洗, 再转移到Transferring buffer中平衡20 min;电泳胶置Transferring buffer中平衡20 min;裁6张与胶同样大小的Whatman 3MM滤纸, 置Transferring buffer中平衡;按下列顺序装好blot:负极—3层滤纸—电泳胶—PVDF膜—3层滤纸—正极。300 mA转膜120 min。转印至PVDF膜上。 2.3.3 封闭 将此膜取下, 剪角后在5%脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动2~4 h。 2.3.4 一抗孵育 将一抗按1∶500稀释, 与膜一起孵育4℃过夜。 2.3.5 二抗孵育 用1×PBST洗涤3~4次, 10 min/次。将此膜与Hrp标记的二抗 (1∶3 000) 一起孵育2 h, 室温。 2.3.6 检测 用1×PBST洗涤3~4次, 10 min/次。 将检测试剂ECL的A液与B液以1∶1的比例混合, 检测试剂的用量为0.1 ml/cm2。 室温下, 与ECL反应50sec。 吸干多余的检测试剂;膜用保鲜膜封起, 暗室曝光, 时间:30 s。用美国BIO-RAD公司Quantity One 分析软件对显影条带进行灰度分析, 将目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。 2.4 统计学处理 实时定量数据采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和t检验, 数据以均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示, 以P值表示统计学差异,P0.05表示差异显著,P0.01表示差异非常显著。 3 大鼠远端结肠c-传统检测 复制卧床便秘大鼠模型两个月后, 开始推拿干预, 持续治疗两个月, 利用Western blot方法进行蛋白的半定量分析, 分