基于16srrna基因的温室黄瓜根围土壤细菌多样性分析.docxVIP

基于16srrna基因的温室黄瓜根围土壤细菌多样性分析 土壤是世界上最大的细菌遗传资源。其物理和化学性质、聚集形成和土壤中污染物的分解以及细菌、群体结构、相互作用、活动和稳定性密切相关。土壤细菌对土壤中的营养循环,有机质的分解和土壤肥力起着很重要的作用,是整个地球生态系统的重要组成部分。研究土壤中的微生物群体有助于我们了解环境可变性对细菌多样性,组成和丰度的影响。 近年来,伴随着人们对反季节蔬菜需求的不断扩大,温室种植面积逐年增加,大量农药化肥的使用,过于倚重于人为的投入,土壤自身微生物的重要性往往被忽视,随之而来的是蔬菜病虫害的严重发生。同时,多年来土地利用类型和结构不断变化,尤其是粮食生产面积的减少和温室种植面积的增加,必然带来土壤生物学性质的变化,尤其是最为敏感的土壤微生物群落结构的变化,这将影响到土壤生态系统的功能发挥和结构的稳定。但目前有关这方面的研究鲜有人涉及,尤其是缺乏对高强度土地利用条件下的土壤微生物多样性的认识。 自然环境中,99% 以上的微生物不可用实验室纯培养的方法获得,成为自然界微生物群落结构、生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。随着分子生物学技术在微生物生态学研究中的应用,微生物多样性的研究有了新的突破。进入20世纪90年代末,随着宏基因组技术的发展,基于宏基因组文库的分析也为微生物多样性结构和功能基因组的研究,提供了崭新的思路。 因此,本试验采用16S rRNA基因克隆文库和宏基因组Fosmid文库末端随机测序两种方法,比较了两者在反应温室黄瓜根围土壤细菌多样性和丰度之间的差异,分析了温室黄瓜根围土壤细菌群落结构组成情况,旨在了解温室黄瓜根围土壤细菌的多样性以及为揭示土地利用变化与生态环境效应之间的关系奠定基础。 1 材料和方法 1.1 样品的采集和预处理 土样于2008年3月采集自海淀区中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验农场黄瓜种植地。种植黄瓜年限10 a以上。采样地选择10 个种植黄瓜的地块。采用五点采样法,用土壤采样器采集5个黄瓜根围土壤样品(采集直径10 cm,采集深度0—15 cm),混合后用密封袋带回,土样用10 mesh(2 mm)筛网过筛,去除小颗粒的石头和残存的植物根系,存放于-20℃冰箱中。土壤性质见表1。 1.2 nywelld,oslo,norw 参考Bertrand等有所改进。改进部分:沉淀用10 mL 0.8% NaCl重悬后,补上10 mL 的PVPP,涡旋混匀,10 000 r/min,4℃离心10 min后弃上清,重复3—5 次,至上清呈淡褐色,沉淀用10 mL 0.8% NaCl重悬。将10 mL Nycodenz(Axis-Shield, Oslo, Norway;8 g Nycodenz溶于10 mL 灭菌水)加入悬液底部,11 000 r/min,4℃离心30 min。小心收集在Nycodenz-土壤混合颗粒和上层水层分界面上的白色细胞层,重悬后在10 000 r/min 4℃离心20 min去除Nycodenz溶液。紧接着用蛋白酶K-溶菌酶-SDS法提取土壤DNA,用100μL TE溶解,1% 琼脂糖电泳检测,-20℃保存。 1.3 pcr扩增及基因克隆 以DNA为模板,细菌16S rRNA基因通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-TACTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR扩增所用反应体系及反应条件参考照文献报道的方法。 扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,回收1500 bp 的片段,连接至pGEM-T (Promega, USA)上,E.coliTOP10转化,涂LB板(含Amp+、IPTG和X-Gal),37℃过夜培养。挑白斑,37℃,220 rpm,摇动培养12 h,每克隆菌液取1μL,用T7 和SP6 进行菌液PCR,筛选阳性克隆,构建基因克隆文库。菌液PCR引物,T7: 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′,SP6:5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′。挑取300个阳性克隆送诺赛基因测序。 1.41 shrenon-wieenr指数sh底指数 用Chimera Check程序将所得16S rRNA序列在核糖体数据库(Ribosomal database project,RDP)进行嵌合体检验,去除嵌合体序列。以97%为划定阈值,用DOTUR软件包划分操作分类单元(OTU),并构建稀缺性曲线。Shannon-Wiener指数依据下列公式进行计算: H= ∑ (pi) (log2p-i) 式中,pi代表每个物种样本数量占总样本数量的比例。 均匀度 (E) =H/Hmax ,Hmax = log2S 丰富度S是样本中物种的数量,这里等同OTU的