自固化磷酸钙人工骨的遗传毒性试验及动物体内植入实验.docxVIP

自固化磷酸钙人工骨的遗传毒性试验及动物体内植入实验 1.1 颗粒的预处理 样品采用cpc生理盐水提取物。制备方法：完全硬化的cpc，用玻璃粉磨成，研磨质量，用20目或40目筛。将颗粒分成大于20目和小于20目而大于40目两组(以下简称20目和40目组)。分别取两组颗粒物各19g均置于小烧杯中,加入生理盐水38ml,各以锡纸封其开口,置37℃恒温水浴内浸润24h。经蔡氏漏斗过滤去菌得到灭菌的CPC浸出液,其浓度为500mg/ml,进行以下试验。浸出液中钙、磷含量见表1。 1.2 阳性对照物的致突变活性检测 采用平板掺入法。使用TA98和TA100两个菌株。大鼠肝脏微粒体酶系(S9)由多氯联苯诱导,制成肝匀浆后在-80℃冰箱内保存,使用时用BaP或2-氨基芴测定其活力。 浸出液用生理盐水作溶剂,两组样品(20目组和40目组)分别稀释成1000ug/0.1ml、2000ug/0.1ml和5000ug/0.1ml。阳性对照物选用2,7-二氨基芴(2,7-AF)、叠氮化钠(SA)和2-氨基芴(2-AF)三种具有不同致突变活性的已知致突变剂。2,7-AF配成100ug/0.1ml,用于TA98菌株的直接致突变活性指示(不加S9);SA配成1ug/0.1ml,用于TA100菌株的直接致突变活性指示;2-AF配成10μg/0.1ml,用于TA98、TA100菌株的间接致突变活性指示(加S9),空白对照用同样体积的生理盐水。 1.3 小鼠骨髓内固定术 40只体重为18～20g的健康雄性昆明种成年小鼠(由上海医科大学动物部提供),随机分成8组,每组5只。以生理盐水为阴性对照,环磷酰胺(CTX)为阳性对照。试验组及阴性对照组每只小鼠分别按体重每次腹腔注射浸出液或生理盐水0.1ml/20g。阳性对照组按体重腹腔注射CTX80mg/kg。两次腹腔注射染毒间隔24h,第二次染毒6h后用颈椎脱臼法将小鼠处死。迅速用剪刀将小鼠的两条股骨剪下,除去筋膜肌肉,剪去股骨两端。用注射器吸取1ml小牛血清插入骨髓腔中,将骨髓冲洗入离心管中,反复冲洗至骨髓腔无血。然后以1000rpm的转速离心5min,弃去上清液,用毛细管轻轻打匀沉淀物,吸少许均匀涂片。每只小鼠涂片两张,待晾干后用甲醛固定,0.25%M-G染液染色,再以1∶10Giemsa染液染色10min,用蒸馏水分色10s,晾干后镜检。 高倍镜下选择细胞分布均匀、染色好的区域油镜下计数骨髓的嗜多染红细胞(PCE)。PCE在油镜下呈灰蓝色,无细胞核。微核直径相当于PCE的1/20～1/5,呈圆形,边缘光滑,染色与其它有核细胞核质一样,呈紫红色或蓝紫色。每片计数1000个PCE,共计数2000个PCE中含有微核的PCE数,一个PCE中出现两个以上的微核时,按一个微核细胞计,结果以‰表示。 1.4 样品的制备 肝细胞悬液的制备,按照我校环境卫生教研室的方法。制备的肝细胞悬液,用DMEM(含5%小牛血清、0.2%白蛋白、20ml羟基脲)稀释至浓度为1×10/ml。 将1×10/ml的肝细胞悬液1ml分装至小试管中,在每个小试管中加入浓度为500ug/ml、200ug/ml、100ug/ml的CPC浸出液5ml,各做3个平行样本。生理盐水作阴性对照,氮芥作阳性对照。每管加H-TdR5μci/ml,37℃恒温水浴震荡培养3h,然后用2ml冰生理盐水终止反应。用多头细胞仪收集细胞至滤膜上,用蒸馏水抽吸两次,依次用5%三氯醋酸1ml固定,75%及无水乙醇脱水,将滤膜37℃烘干,放入闪烁杯中,加入0.5ml闪烁液,在Backman液闪计数仪上测定CPM值。 1.5 骨洞钻穿设计方法2个月组 健康新西兰白兔12只,体重2.5～3.5kg,雌雄不限。随机分成4组,每组3只。根据观察时间不同,分别称为A组(半个月组)、B组(1个月组)、C组(3个月组)和D组(6个月组)。 3%戊巴比妥钠静脉麻醉,俯卧位固定,单侧下肢脱毛。在无菌条件下,于股骨外侧髁处纵行切开皮肤,显露股骨外侧髁。用4.5mm的钻头,从外髁向内侧髁横行钻孔。钻穿后,冲净骨屑。测量骨洞的距离。然后将制备的柱状CPC(方法略)用手术刀片切成相应长短,植入到骨洞内,逐层缝合切口。 1.6 内部肌肉移植 在骨内植入后,于同侧肢体的臀外侧部另做切口,分离肌肉成一肌袋,植入5mm的柱状CPC,观察时间同前。 2 结果 2.1 ases测试 Ames试验结果见表2。 结论:试验结果为阴性。CPC浸出液不引起鼠伤寒沙门氏菌回复突变数增加。 2.2 微测试 微核试验结果见表3。 结论:CPC浸出液与对照组相比未引起小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检出率的升高。 2.3 uds测试 UDS试验结果见表4。 结论:与对照组相比,CPC浸出液未见有引起大鼠肝细胞程度外DNA合成增加的作用。 2.4 基丙