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基于超声成像技术的人桡骨骨内三维结构的研究 自然骨骼中存在复杂的微管结构，通过微管结构进行保障血液和养分循环，并维持骨的生长和重建。本研究利用连续切片—图像反求建模三维重构的方法重构了皮质骨三维显微结构模型,针对重构过程中关键的图像配准问题,采取了软硬件结合的方法,得到图像配准,采用Mimics软件将其转换至三维空间,利用I-DEAS将点云模型构建为实体模型。最后对实体模型进行测量,计算出微管空间形态数据。本研究得到哈佛氏管以及福克曼管的空间特征,可以指导人工骨内微管结构的设计,对仿生骨研究和使人工骨技术由仿形走向仿生具有重要意义。由于受研究条件的限制,此类研究国内外报道极少。 材料和方法 一、 显微镜电路 人桡骨中段,由第四军医大学西京医院提供,为教学标本,经75%酒精浸泡保存。主要硬件:LEICA SP 1600型切片机、KEYENCE VH-Z450型显微镜,放大倍率×25～×3000,显示屏分辨率1620×1220。显微镜自带操作系统以及图像处理软件,可完成长度、角度等测量。主要软件:Osiris(日内瓦大学医院开发)、MATLAB(Math Works公司开发)、Mimics (Materialise公司开发)、I-DEAS(EDS公司开发)。 二、 方法 1. 甲基丙烯酸甲酯片制备 取20mm长桡骨标本,用油石、1200#金相砂纸研磨出三个沿骨长轴方向的定位面(图1)。标本脱水后抽真空(-0.64大气压)6h,将浸塑(甲基丙烯酸甲酯)后的标本放入直径10mm、高30mm的玻璃容器中,注入包埋介质。容器置于60℃热水中水浴3h,经过聚合反应,完成包埋。使用LEICA SP 1600型切片机制作切片。切片间距400μm。 2. 3d重建 (1) 旋转与平滑模式 显微镜拍摄切片图像,放大倍率×175。在切片以及图像获取过程中,切片位置会有变化,主要为旋转与平移,共需调整3个自由度。利用MATLAB图像处理工具箱提供的函数以及定位点可完成图像配准工作。 利用cpselect()函数,在相邻两幅图像中,选择两对对应定位点作为控制点。微调控制点,确定图形变换参数,完成图像配准(图2)。 (2) 划分边界时的图像进行调整 利用Osiris软件划分哈佛氏管以及福克曼管。在哈佛氏管内部选取一点,指定灰度阈值,Osiris软件自动划分哈佛氏管边界。划分前后两幅图像相减,得到边界。为方便后续图像处理,将边界二值化。由于划分边界所用图线颜色在某些区域可能与其覆盖的颜色接近,图像二值化后,边界可能是不封闭的。使用imdilate()函数将图像放大,封闭边界。结构元素使用垂直与竖直,长度为2个象素的线段。最后填充图像(图3)。 (3) 维模型的建立 将经过配准以及分割的图像按照切片顺序导入Mimics软件。Mimics需要切片间距以及象素尺寸作为参数,按照正确比例重构三维模型。其中切片间距为0.4mm;二维图像进行处理后,图像尺寸为1620×1220象素,KEYENCE显微镜测量的图像尺寸为1982.38×1492.60μm,因此象素实际尺寸为1.2237×10-3mm。 设定图像方向并选择mask颜色后,Mimics根据二维图像计算三维模型。Mimics图像观察、测量均不方便,因此将图像输出为IGES格式(图4)。 骨内微管结构的提取 利用人桡骨标本进行切片,行显微镜拍摄,得到图像,经过配准以及分割,然后建模得到的三维显微结构真实地反映了人桡骨的骨内微结构,我们将其中一些重构比较完全的微管结构提取出来(图5),根据三维模型直接行形态数据测量,结果见表1。 讨论 一、 连续切片-三维重构技术 三维重构主要有两类方法:无损成象技术和连续切片-三维重构技术。其共同点是首先获取标本的连续截面图像,然后将二维图像重构为三维实体模型。 对于无损成象技术, 目前只有显微CT(micro CT,μCT)可以达到微米级的分辨力,但国内显微CT分辨力不高,(清华大学的为40μm),难以分辨平均直径仅为50μm的哈佛氏管、福克曼管。所以我们采用连续切片-三维重构技术,其基本步骤为连续切片、获取切片图像、图像配准、三维重构。对于连续切片-三维重构来说,图像配准是关键问题,因为在制片或者图像采集过程中,数字序列图像每两层之间都存在错位现象,即旋转、平移等变形。本研究利用切片前制作的定位基准以及MATLAB的图形处理工具箱提供的图像配准函数,通过选择控制点(定位点)完成图像配准,就可以达到定位效果。通过连续切片-三维重构技术建模可得到比较完整的哈佛氏管。 二、 结构的角度与大小 由于切片厚度太大,也就是采样间隔过大,导致信息丢失严重。一些哈佛氏管找不到相邻切片中的对应组织,在实体模型上的表现是有块状或者短条实体存在,而不是完整的哈佛氏管。当然模型边缘部分的块状有可能