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土壤中杀菌活性成分的分离与鉴定 黄瓜是由香蒲1引起的一种短而易受刺激的叶片疾病引起的。这也是黄瓜生产中最重要的疾病之一。黄瓜的整个生长时间也可以受到影响，并且容易受到影响。黄瓜染病后叶片上产生白色粉状物,影响叶片的呼吸和光合作用,严重时可造成叶片大量干枯,苗期造成长势减弱甚至死亡,生育期造成瓜果畸形、品质下降、产量降低,导致严重的经济损失。随着保护地栽培的发展,此病的危害越来越严重。 自20世纪70年代以来,主要采用化学农药防治黄瓜白粉病,先后施用托布津、粉锈宁、多菌灵等。由于化学农药的长期、大量、不合理使用,其弊端日益突出,如造成农药残留、人畜中毒、环境污染、有害生物抗药性增强等,严重影响了人们的生活和生态平衡。随着环境法规的健全和公众环保意识的增强,单纯追求粮食产量的农业种植观念和种植结构必然转向注重“绿色食品”,农药产品的升级换代势在必行。微生物源农药以其自身无残留、不易产生抗药性且易与其它药剂混配等特点,受到人们的青睐。因此,从微生物次级代谢产物中寻找出有优良杀菌效果而又易于为自然界分解、无残留的新型杀菌剂成为国内外新农药研究的热点之一。 SPRI10304 系上海农药研究所从苏州地区采集的土壤样品中分离到的一株放线菌。该菌株的发酵产物对黄瓜白粉病具有较明显的防治效果。通过对杀菌活性物质的提取分离及化学结构鉴定,确定其为2-乙酰基-3-甲氧基呋喃,俗名异麦芽酚甲醚,经检索,这种化合物还未曾有杀菌方面的报道。作者在此主要从菌种的发酵、活性物质的提取分离与结构鉴定、生物学等方面进行了阐述。 1 实验 1.1 菌株s、玉米小斑病菌hm、fg、ba、碳疽病菌三品种图1 放线菌SPRI10304从苏州地区采集的土壤中分离得到。 实验用稻瘟病菌Po(Pyricularia oryzae)、水稻纹枯病菌Rs(Rhizoctonia solani)、玉米小斑病菌Hm(Helminthosporium maydis)、小麦赤霉病菌Fg(Fusarium graminearun)、黄瓜白粉病菌Sf(Sphaerotheca fuliginea)、黄瓜灰霉病菌Bc(Botriytis cinerea)、炭疽病菌Cl(Collectotrichum lagenarium),由上海南方农药研究中心提供。 1.2 红外光谱及核磁共振测定 SHIMADZU SPD-10A型制备高效液相色谱仪;液质联用Agilent Technologies 1200 Series;Nicolet Magna-IR 500型红外光谱仪;VARIAN 500 MHz核磁共振仪(CD3OD为溶剂,TMS为内标);硅胶层析柱(2.5 cm×100.0 cm,定制),填料:100~200目硅胶;HSGF254型薄层层析板,烟台汇友硅胶开发有限公司。 1.3 活性物质的分离纯化与鉴定 斜面培养基:高氏1号,即每1000 mL摇瓶培养基中含可溶性淀粉20.0 g,K2HPO40.5 g, NaCl 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KNO31.0 g,FeSO40.01 g,琼脂18.0 g,蒸馏水1000 mL,pH值7.2~7.4;于121℃湿热灭菌30 min,固化后接种于28℃培养7 d备用。 发酵培养基:1%可溶性淀粉,2%葡萄糖,2.5%黄豆粉,0.4%酵母粉,0.1%牛肉膏,0.2%NaCl, 0.005%K2HPO4,pH=7.2;分装于250 mL三角瓶中,每瓶50 mL。在121℃下湿热灭菌30 min。在无菌室中接入菌种,(28±1)℃、220 r·min-1振荡培养96 h。 1.4 SPRI10304杀菌活性物质的分离纯化与鉴定 10 L发酵液离心分离后,滤饼用80%丙酮在4℃浸泡过夜,离心,得丙酮浸泡液。浓缩脱去丙酮,与离心得到的上清液混合,用2倍体积乙酸乙酯萃取2次,合并乙酸乙酯相,浓缩得到深黄色油状物6.3 g,待用。 氯仿溶解上述油状物并加入硅胶20 g混合均匀,减压蒸干得粉末状固体,作硅胶柱层析时固体加样用。称取100~200目硅胶200 g,以氯仿为溶剂,装柱。用甲醇∶氯仿=1∶60(体积比)作为洗脱液进行洗脱。每25 mL为一份进行收集,共得到50份收集液,对各部分分别进行杀菌活性测定,合并活性部分后减压浓缩,得到的活性物质粗品为浅黄色油状物。 此浅黄色油状物经过硅胶薄层层析分离,展开剂为甲醇∶氯仿= 1∶40(体积比)的溶液。展层后对各条带进行杀菌活性测定,从硅胶薄板上刮下含活性条带的硅胶粉(RF=0.38),合并多次薄层层析所得的活性条带硅胶粉后,用甲醇溶出,浓缩后用高效液相色谱进一步分离、制备。高效液相色谱的制备条件为:色谱柱为惠杰 YWG C18, 20 mm×250 mm,10 μm;流动相为甲醇∶水=18∶82