影响cmc羧甲基纤维素钠糖化力法测定纤维素酶活性的主要因素.docxVIP

影响cmc羧甲基纤维素钠糖化力法测定纤维素酶活性的主要因素 维生素是植物纤维的主要成分。由于其本身很难被消化，一些养分的消化利用对饲料中的各种养分的消化和利用起到了明显的干扰和抑制作用。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。研究表明，向饲料中添加纤维素酶，不仅能有效地消除纤维素的抗营养作用，而且能促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，提高饲料代谢能值和动物的生产性能，增进畜禽健康，减少畜禽排泄物对环境的污染及拓宽饲料原料的范围。因此，纤维素酶在饲料工业中具有广阔的应用前景。 但长期以来，纤维素酶酶活的分析测定一直是困扰纤维素酶生产和应用的主要难题之一。这是因为纤维素酶是一种多组分的复合酶，不同来源的纤维素酶的组成及各组分的比例有较大差异；同时，纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶酶活的测定方法很多，且复杂而不统一。常用的测定方法有：CMC糖化力法、CMC液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。国内许多单位分别采用了上述各种方法并进行了种种修改使测定方法更加多样化。在上述测定方法中，CMC糖化力主要代表内切β-1, 4葡聚糖酶酶活，在研究和实际生产中应用比较普遍，但具体的测定条件也有较大差异。例如，测定波长从490～570 nm、底物浓度从5～20 g/l、酶促反应时间从5～30 min都有研究者选用，这就造成了不同产品、不同结果之间无法相互比较。因此，研究和建立合理统一的纤维素酶酶活测定标准很有必要。针对上述问题，本文对影响CMC糖化力法测定纤维素酶酶活的主要因素进行了研究，以期为制定统一的纤维素酶的酶活测定方法提供参考依据。 1 材料和方法 1.1 纤维素酶酶 氢氧化钠、酒石酸钾钠、3, 5-二硝基水杨酸、苯酚、无水亚硫酸钠、葡萄糖、醋酸、醋酸钠、羧甲基纤维素钠、纤维素酶。上述试剂中，除纤维素酶为黑曲霉发酵产品外，其余均为分析纯。 1.2 设备和设备 UV-2450型紫外分光光度计、UV-2000型分光光度计、恒温水浴锅、电子分析天平、PHS-3C数字式酸度计、电子调温电炉。 1.3 测试方法 1.3.1 酶溶液的制备 准确称取纤维素酶1.00 g，用pH值为4.6的0.2 mol/HAc-NaAc适当稀释后，做为待测酶液。 1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制 取7支25 ml比色管，分别加入1.0 mg/ml的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml，补加蒸馏水至2 ml，加入定量的DNS试剂，沸水浴显色后定容，在适宜的波长条件下测吸光值A，以A为横坐标，葡萄糖含量为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。 1.3.3 ds-ms/ds法 25 ml具塞试管中加入1.5 ml以0.2 mol/l pH值为4.6 HAc-NaAc缓冲液配制的1%CMC溶液，置于40℃水浴中热5 min，加0.5 ml适当稀释的酶液，40℃准确反应30 min，加入DNS试剂，沸水浴显色后定容至25 ml，摇匀。以相同条件下沸水浴灭活5 min的酶液为空白，在适宜的波长条件下测定吸光值。然后在相应的葡萄糖标准曲线上求得生成的葡萄糖的量。 酶活单位的定义：上述反应条件下，1 min水解CMC产生1μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位，以U表示。 2 结果与分析 2.1 最大吸收波长的确定 在400～600 nm波长范围内，分别对酶解产物与DNS显色反应后的生成物及空白显色剂的吸光特性进行了扫描分析（见图1）。 从图1中可以看出，显色后的生成物在波长410～600 nm均有吸收值，其最大吸收峰在483 nm处；但显色剂在480～530 nm波长范围内有较明显的光吸收。比色分析中，显色剂是过量的，因此，测定波长的选择应避开此范围以消除显色剂对分析的干扰。在540 nm处，DNS本身的吸光值显著降低，接近它的最低值，且酶解产物与DNS的反应产物仍有较强的光吸收，在此波长下测定的结果受DNS的干扰小，符合“吸收最大，干扰最小”的原则。因此，选择540 nm作为测定波长，这样在测定时，既可保证测定的灵敏度，又能避免显色剂的干扰，提高了测定的准确度。 2.2 显色剂添加量 分别取DNS试剂0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，在相应的标准曲线下测定同一酶，测定结果见图2。图2表明，当DNS添加量为0.5 ml时，测定结果明显低于其它添加量的结果；而当DNS添加量在1～3 ml范围内时，测定结果没有显著差异。图2结果说明DNS用量为0.5 ml时，DNS添加量不足，显色反应不完全；添加量在1～3 ml范围内，显色剂都是过量的。显色剂添加量大，会使空白偏大，且测定的吸光值偏大，测定范围变窄；显色剂添加量少，则试验误差相对较大。为确保显色反应进行完全、减少试验误差，本实验选择DNS试剂添加量为1.5 ml。