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溴麝香草总生物碱测定方法的比较 100%是咳嗽和哮喘药，具有润咳、止咳、杀虫的功效。2010版《药典》收载了直立百部、蔓生百部和对叶百部3种。但是对3种百部的定性鉴别和含量测定均无记录。究其原因主要是百部品种杂多, 且其化学成分差异大, 即使是同种百部, 其地域差别引起的化学成分变化也十分显著。对于百部止咳、杀虫功效研究较多, 文献报道其主要有效成分为生物碱类化合物。目前, 已经在百部中分离出100多种生物碱, 其中部分生物碱具有止咳、杀虫活性, 但事实上百部用来止咳、杀虫时是其总碱共同的作用。而目前对于百部总碱测定方法的研究文献很少, 仅对蔓生百部总碱测定方法研究比较全面。对叶百部和蔓生百部化学成分区别很大, 对于其总碱含量测定方法未见报道, 本论文分别对测定总生物碱最常用那个的3种方法进行了比较研究, 旨在寻找对叶百部总碱含量测定最适合的方法, 以期能够为《药典》提供依据。 1 实验部分 1.1 对照品及试剂 岛津U3100紫外可见分光光度计;粉碎机 (无锡新标) ;超声仪 (深圳迈瑞生物) ;旋蒸仪 (上海亚荣) 。 百部药材购于安徽毫州药材市场, 产地为湖北, 经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为对叶百部。对叶百部碱对照品购于上海源叶有限公司。雷氏盐 (A.R.上海化学试剂公司) ;溴麝香草酚蓝 (A.R.上海化学试剂公司) ;溴甲酚绿 (A.R.上海化学试剂公司) ;水为双蒸水。 雷氏盐法样品溶液制备:药材粉末5.0032g, 加入0.1%HCl超声处理40min, 过滤定容至50 m L。 酸性染料法:取百部粗粉0.5026 g, 置100m L具塞三角烧瓶中, 精密加入50m L甲醇, 称定重量, 超声提取30min, 放冷, 补足甲醇的重量, 过滤, 滤液旋蒸至干, 加入一定体积的4%HCl以35%NH3·H2O调解溶液p H值至9~10, 沉淀用CHCl3萃取后定容至10m L。 2 方法和结果 2.1 测试方法 2.1.1 最大吸收波长测定 取25m L雷氏盐样品溶液, 加入新鲜配制的2%雷氏盐溶液10m L, 置冰箱4℃过夜, 沉淀在3000r·min-1离心10min, 弃去上清液, 沉淀以冰水洗涤至无颜色, 加入5m L丙酮溶解, 于紫外可见分光光度计上在400~600nm范围内扫描测定其最大吸收波长为529nm, 在该波长下测定其吸光度值为0.525。 2.1.2 缓冲液结合剂的选择 酸性染料测定生物碱方法的原理是酸性染料与生物碱在酸性条件下可以生成稳定的配合物, 其生成物与缓冲液的酸度及酸性染料加入量有关系。常用的测定生物碱的酸性染料主要有溴麝香草酚蓝法和溴甲酚绿法, 因此, 本实验分别对这两种方法进行了考察。 2.1.2. 酸性染料检测 显色反应条件中p H值条件和显色剂用量是主要的影响因素, 本实验对酸性染料法中两种方法分别进行了该两个实验条件的选择。实验过程如下:取0.3m L酸性染料样品, 加入5m L不同p H值磷酸缓冲盐, 3m L酸性染料溶液, 一定体积CHCl3萃取二次, 每次振摇30s, 静置10min, 取CHCl3层定容到10m L, 在412nm下测定其吸光度值。结果见表1。 由表1可见, A1为溴麝香草酚蓝法测得吸光度值, A2为溴甲酚绿法测得吸光度值, 说明p H值为6.5是溴麝香草酚蓝法测定的最佳酸度条件, p H值为5.0是溴甲酚绿法测定的最佳酸度条件。 2.1.2. 酸性染料体积的测定 取0.3m L酸性染料样品, 分别加入上述实验条件最佳p H值缓冲液5m L, 改变酸性染料的体积, 其他步骤同上, 测定其相应的吸光度值, 结果见图1。 从图1中可以看出, 两种方法均是加入3m L酸性染料后其吸光度基本稳定, 因此, 选用加入3m L为显色剂加入的最佳体积。 2.23 样品实验结果 本实验考察了3种方法测定的灵敏度, 以△A△C表示, 实验样品为上述实验方法中样品, 实验过程同上述实验。实验结果见表2。 由表2结果表明, 3种测定百部生物碱测定方法中溴麝香草酚蓝法灵敏度最高, 有可能适合测定对叶百部中总碱的量。 2.3 测定方法的选择 上述实验中我们考察了不同方法测定百部总碱的灵敏度, 但是在实际测定过程中除了灵敏度外, 实验方法的线性、稳定性等也很重要。本实验以对叶百部碱为对照品, 按照溴麝香草酚蓝法测定总碱的过程, 进行了系统适用性考察, 并对样品的生品和制品进行了总碱含量测定。 2.3.1 标准曲线的绘制 精密称取对叶百部碱对照品1.36mg, 以CHCl3配置成10m L溶液, 分别吸取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3m L对照品溶液, 按照溴麝香草酚蓝法, 测定吸光度值, 绘制标准曲线, 表明对叶百部碱在4.08~17.08μg·m L-1