独活乙醇提取物及不同萃取部位抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性研究.docxVIP

独活乙醇提取物及不同萃取部位抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性研究 独活是一门属于伞科的植物的重齿毛当归。f.bierratasaan和其他人的干燥根可以去除风、湿、关节和疼痛。始载于《神农本草经》,被列为上品,自古以来作为治疗风湿痹痛的要药。随着现代药理学研究的深入,发现独活对老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)模型大鼠和小鼠的学习记忆能力具有一定的改善作用。AD 的发病机制复杂,病因学尚未完全清楚,其中中枢胆碱能神经功能失调被认为是老年性痴呆的重要发病机制,乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)为促进学习记忆的神经递质,运用胆碱酯酶抑制剂来提高AD患者的乙酰胆碱水平,是目前惟一被普遍认可的药物治疗手段。在人体中有2种酶水解乙酰胆碱,即乙酰胆碱酯酶(AChE,亦称真性胆碱酯酶)和丁酰胆碱酯酶(BuChE,亦称假性胆碱酯酶),目前用于临床的胆碱酯酶抑制剂多是选择性AchE抑制剂,但外周副作用较大,长期治疗效果不理想。新近研究表明,选择性BuChE抑制剂可使细胞外乙酰胆碱浓度增加15倍,且未发现胆碱样副作用。因此,寻找BuChE选择性抑制剂或AChE和BuChE的双重抑制剂,可为AD的治疗提供新的策略。本研究采用薄层色谱-生物自显影技术和微孔高通量筛选方法研究和探讨独活醇提物抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的活性及其活性部位。 1 设备和材料 1.1 仪器和检测方法 人工气候箱(宁波莱福科技有限公司);定量毛细管(美国MICROPET);玻璃喷雾瓶、玻璃匀浆器(华西医科大学仪器厂);加热板(美国FISHER);离心机(德国Thermo);旋转蒸发仪(德国Heidolph VV4000);恒温水浴锅(GB11240-89型号GSY-II型,北京医疗);低温高速离心机(德国Thermo);微孔板扫描酶标仪(美国BioTek);SSW型微电脑电热恒水槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);电子分析天平(上海天平仪器厂)。 1.2 药品、试剂与仪器 独活(祥威饮片厂,由中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为伞形科当归属植物重齿毛当归Angelica pubescensMaxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根,符合中国药典2010年版一部规定);实验小鼠[北京军事医学科学院动物中心,均为健康雄性小鼠,体重20～24 g,许可证号:SCXK(军)2007-004];碘化硫代乙酰胆碱(A5751,纯度≥98%)、氯化丁酰胆碱(B2753,纯度≥98%)、5,5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB、D8130,纯度≥98%)、醋酸-β-萘酯(N6875,纯度98%)、醋酸-α-萘酯(N8505,纯度≥98%)、牢固蓝(Fast Blue B Salt)(D9805,纯度:95%)、他克林(A3773,纯度99%)、四异丙基甲基焦磷酰胺(iso-OMPA,T1505,纯度99%)、十二烷基硫酸钠(SDS,酶终止剂,纯度95%)均购自SIGMA公司;氢溴酸加兰他敏(中国药物生物制品检定所,含量:100%,批号:100050-200802);PBS磷酸盐缓冲液(索莱宝生物科技公司);薄层色谱硅胶预制板(烟台市化学工业研究所);96孔板(Costar 3599 美国);二甲基亚砜(DMSO)、石油醚、正己烷、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等化学试剂为分析纯(北京化工厂)。 2 方法和结果 2.1 样品溶液的制备 2.1.1 抗酶试验阳性药物的制备 称取氢溴酸加兰他敏及四异丙基甲基焦磷酰胺各20 mg,分别用1 000 mL甲醇溶解。 2.1.2 高流量法测定抗酶试验阳性药物的制备 称取他克林及四异丙基甲基焦磷酰胺各2 mg分别用2 mL DMSO溶解。 2.1.3 独活乙醇分离纯化 称取独活根粗粉100 g,依次用80%乙醇提取2次,50%乙醇提取1次,合并提取液,将其粗提液旋转蒸发至无乙醇,取少量放入蒸发皿中至水分挥干,得到独活乙醇粗提物,剩余部分加入50 mL蒸馏水,依次用适量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,浓缩各萃取液即得到独活的石油醚、氯仿、乙酸乙酯部位、正丁醇和水层5个部位。 3自适应生物成像技术用于抑制酶试验的制备 称取独活的乙醇提取物,石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位各2 mg,分别溶解于100 μL的甲醇,即得。 3国产高通量优惠剂、气氛设计 分别称取乙醇提取物,独活的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位各2 mg分别溶解于2 mL的DMSO,即得。 2.1.4 无水乙醇底物溶液 分别取0.10 g醋酸-β-萘酯和 0.05 g醋酸-α-萘酯溶解于100 mL无水乙醇作为底物,放入冰箱中备用;分别取7.2 mg碘化硫代乙酰胆碱和氯化丁酰胆碱,分别用PBS溶液定容