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生物样品液相色谱-质谱lc-ms分析中基质效应的评定 基质是分析对象以外的一组成分。这些干扰通常会严重干扰分析对象的分析，从而影响分析结果的准确性。这些影响和干扰被称为基本效应。液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)是将分离性能优异的液相色谱法与灵敏、专属、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法相结合的现代分离分析技术,近年来发展迅速,在生物样品分析中发挥了极大作用[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17],但LC-MS普遍存在基质效应。串联质谱以特异性强著称,但越来越多的数据表明质谱检测同样需要注意避免基质效应[18,19,20,21,22,23],否则,将影响数据的准确性。 基质效应可影响检出限(LOD)、定量下限(LOQ)、线性、准确度和精密度,对后3者的影响在不使用同位素内标时将更明显。因此,LC-MS分析时必须考察基质效应。国内有关液相色谱-质谱分析中基质效应的讨论较少,许多文献的LC-MS方法验证中未考察基质效应。 本文在应用LC-MS的经验基础上,结合国内外文献[1,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48],介绍了液相色谱-质谱分析中基质效应的产生机制、来源、评定方法和消除措施。 1 非挥发性基质组分 LC-MS/MS中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致,表现为离子增强或抑制作用。King等实验发现,基质效应由形成带电雾滴时非挥发性的基质组分与分析物离子竞争产生,这些非挥发性基质组分将雾滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。根据接口处离子化和离子蒸发过程中的变化情况,这种竞争可能妨碍(离子抑制)或增强(离子增强)所分析目标物离子的形成效能,亦即分析目标物离子的形成效能与进入电喷雾源的基质密切相关。 2 接枝型对接生物样品的性质分析 基质效应主要来源于生物样品的内源性组分。内源性组分是指生物样品中存在的有机和无机成分,经前处理后仍存在于提取液中。包括离子颗粒物成分(电解质、盐类)、强极性化合物(酚类、色素)和各种有机化合物(糖类、胺类、尿素、脂类、肽类及其分析目标物的同类物及其代谢物)。其中磷脂是最主要的内源性组分,其对电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)均会产生离子抑制作用,具有表面活性的甘油磷脂酰胆碱是最强的内源性组分。 外源性组分在生物样品中不存在,但同样会带来基质效应,其由样品前处理过程引入,包括塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、清洁剂(烷基酚)、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、流动相等。Mei等通过生物样品分析发现,不同品牌的塑料管中的聚合物或抗凝管中的肝素锂等也可产生基质效应。另外,APCI离子化方式比ESI对基质效应更敏感。基质效应不但与离子化方式有关,而且与各个仪器厂家的源设计也有关。 3 评估基本影响 通过评定基质对分析物信号的影响程度,可大致将基质效应的评定归结为2种方法:柱后注射法和提取后添加法。 3.1 注射分析是否会影响离子化效率 柱后注射法属于动态方法,注射泵和接色谱柱的液相系统通过三通接头与质谱连接(图1)。注射泵恒流注射一定浓度的分析物;生物样品不添加分析物,提取后按已定的色谱条件进样,记录分析物的响应,此方法可考察整个色谱循环的基质影响。需要注意的是,注射分析物浓度应在所需要分析的浓度范围内,若浓度过高,可能影响离子化效率而使结果出现偏差。 柱后注射法可通过基质效应在一个色谱循环中的出现和消失,清楚地显示不同样品前处理的影响、分析柱的适用性和基质效应的作用机制。Taylor等以免疫抑制剂西罗莫司(50 mg/L)柱后注射,选用3种不同的进样方式对西罗莫司选用离子对m/z931.6/864.6进行选择反应监测模式检测发现,流动相进样,整个色谱循环中信号无变化;乙腈沉淀蛋白的样品,大部分色谱过程被抑制;经SPE法处理的样品,在出峰较早的时间段内有较小的抑制,其后则信号强而稳定,没有抑制。说明采用SPE法处理,基质效应不明显,优于乙腈沉淀蛋白方法。 3.2 提取回收率和基质效应 采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应在LC-MS/MS中使用的最多,而且,此法可同时考察提取回收率。按照Matuszewski等的建议,比较3个不同条件下的信号峰面积平均值,其中,Set1:纯的标准品溶液,Set2:不同来源的生物样品基质提取后添加,Set3:不同来源的样品基质提取前添加,则基质效应(ME)=Set2/ Set1,提取回收率(RE)=Set3/ Set2,方法过程效率(PE)=Set3/ Set1。这种考察方法可更全面、客观地量化评价