普通野生稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻的pi-a+基因的克隆与分析.docxVIP

普通野生稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻抗水稻的pi-a+基因的克隆与分析 水稻是由水稻引起的最重要的水稻疾病之一。随着高产、矮秆、多孽良种的推广以及种植密度和施氮量的增加,其危害日趋严重。自20世纪90年代以来,中国稻瘟病发生面积每年都在380万公顷以上,年损失稻谷达数亿公斤。对稻瘟病的防治目前以化学农药防治和种植抗性品种为主。抗性品种的种植可以减少农药的使用而带来的环境污染。但由于稻瘟病菌变异很快,易出现新的生理小种,多数抗性品种在种植几年后就逐渐丧失抗病性,故要求不断有新的抗性品种和发现并利用新的抗性基因。 抗病(Resistance,R)基因的克隆及其功能基因组学研究是当前农作物基因工程研究的热点,已有40多个植物R基因被克隆。在水稻中已鉴定出40多个抗稻瘟病主效基因位点,并分别被定位到水稻除第3条染色体外的11条染色体上。水稻中已克隆的抗稻瘟病基因有4个:Pib、Pi-ta、pi-hit-1和Pi9。Bryan等首先通过作图的方法从日本栽培稻社糯(Yashiro-mochi)中克隆到Pi-ta基因。Pi-ta基因是目前发现的较为有效的广谱抗稻瘟病主效基因,对含有AVR-Pita基因的稻瘟病菌具有很强抗性。Pi-ta基因含有2个外显子,其c DNA长2 784 bp,编码由928个氨基酸残基组成的NBS-LRR类细胞质膜受体蛋白,其N端无典型的结构域,中部为核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site,NBS),C端为富含亮氨酸结构域(leucine rich domain,LRD)。对来源于稻瘟病抗性和敏感性水稻的Pi-ta基因序列分析发现,抗病水稻品种中Pi-ta+与感病感病水稻品种的pi-ta-基因产物之间仅有一个氨基酸残基的差异,即:918位点上Pi-ta+基因产物为丙氨酸而pi-ta-等位基因的该位点为丝氨酸。Pi-ta基因为单拷贝基因,在抗病和感病水稻中均有少量的组成性表达。贾育林等研究证明Pi-ta基因编码的产物与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita编码的产物之间直接相互作用,并且它们的相互作用符合精典的基因对基因(gene-for-gene)假说。 野生稻作为栽培稻的祖先,长期处于野生状态经受各种灾害和恶劣环境的选择,具有各种抗性和耐不良环境的优良特性,如耐病、耐寒、耐阴、耐旱、耐淹、耐盐碱、胞质雄性不育,这些优良的性状是栽培稻遗传改良的重要物质基础。云南省拥有普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻3种野生稻资源。对云南野生稻进行稻瘟病抗性的鉴定,发现云南元江普通野生稻不抗稻瘟病,景洪普通野生稻大部分抗不同病害,而本研究的前期鉴定结果表明景洪直立型紫杆普通野生稻高抗稻瘟病。从云南元江普通野生稻中分离的Pib和Pi-ta基因发现Pib基因由于第一外显子87 bp的缺失,而被认为不具有栽培稻中的Pib基因的抗稻瘟病功能;而元江普通野生稻所含有的Pi-ta基因属于pi-ta-等位基因,因此元江普通野生稻不抗稻瘟病。 既然景洪直立紫杆普通野生稻高抗稻瘟病,其内是否具有抗病的Pi-ta基因呢?为此,本研究依据报道的两个日本栽培稻Pi-ta基因序列(基因登录号为AF207842和AK066558)设计了3对引物,从景洪直立紫杆普通野生稻中克隆了该基因完整的编码框、内含子及部分非编码区(untranslated region,UTR)序列,并对获得的序列进行了分析。 1 材料和方法 1.1 dna催化剂和试剂 本实验以景洪直立型普通紫杆野生稻(Oryza rufipogon Griff)为材料(取自云南省农业科学院生物技术所的温室)。克隆载体为天根生化科技有限公司的pGM-T,Taq DNA聚合酶购自上海申能博彩生物科技有限公司,Long Taq DNA聚合酶购自天根生化科技有限公司,DNA纯化试剂盒购自博大泰克生物基因技术有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成,DNA测序由北京华大基因有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 dna的提取 取适量的上述野生稻的幼嫩叶片液氮速冻后研磨成粉状,用CTAB法提取总基因组DNA。提取的DNA用紫外分光光度计检测,选取OD260/OD280值在1.8-2.0的样品于-20℃保存备用。 1.2.2 pcr扩增pi-ta基因 以NCBI报道的日本栽培稻Pi-ta基因全序列(AF207842和AK066558)为模板,用软件Primer Premier 5.0合成3对引物,引物序列如下: P1:GCTGTCAAATCAGCAACTAACGAGGC; P2:GTCGATCAACCTCCCAAACAT。 P3:TCAGTCTTCGGATGTTTGGGAGG; P4:TCAAACAATCATCAAGTCAGGTTGAAG。 P5:CA