流式微球技术检测血小板特异性抗体.docxVIP

流式微球技术检测血4噬特异性抗体 李锦霞;杨炳华;何杨;赵益明;朱明清;阮长耿 【摘要】目的建立流式微球技术检测血小板特异性自身抗体方法，并对方法学及临 床应用进行初步探讨.方法用包被抗血小板膜糖蛋白(GP)I b、Hb、Ba、H b/ma单克隆抗体的微球捕获与血小板GP结合的特异性抗体，加入FITC标记的羊 抗人IgG抗体后用流式细胞仪检测分析.结果特发性血小板减少性紫瘢(ITP)组4种 单抗荧光强度比值与非ITP血小板减少组和正常对照组有显著性差异(P0.01);若 将ITP组患者4种单抗荧光强度比值分别大于正常对照组上限1.37、1.24、1.48 和1.19判断为阳性，则流式微球技术检测血小板特异性自身抗体的敏感性为73.2%, 特异性为94.3%;4种单抗联合检测总体敏感性明显高于改良间接单抗特异的血小 板抗原固定试验(MAIPA)(P0.05),且大于各单个抗体检测敏感性.结论流式微球技 术可以简便、快捷地检测血小板膜糖蛋白特异性抗体，联合检测多种自身抗体可以 提高检测阳性率,对于ITP的诊治具有一定的临床价值. 【期刊名称】《临床检验杂志》 【年(卷)，期】2010(028)002 【总页数】3页(P110-112) 【关键词】流式微球技术启身抗体;糖蛋白;血小板减少 【作者】李锦霞;杨炳华;何杨;赵益明;朱明清;阮长耿 【作者单位】苏州大学附属第一医院检验科，江苏，苏州,215006;苏州大学附属第一 医院检验科，江苏，苏州,215006;江苏省血液研究所，江苏，苏州,215006;江苏省血液研 究所，江苏，苏州,215006；江苏省血液研究所，江苏，苏州,215006；江苏省血液研究所, 江苏，苏州,215006 【正文语种】中文 ［中图分类】R446.11 特发性血小板减少性紫瘢（idiopathic thrombocytopenic purpura , ITP）是由于 血小板特异性自身抗体介导的血小板破坏引起血小板减少所致的出血性疾病，临床 诊断主要依靠病史、临床表现、实验室检查和对其他原因引起的血小板减少症的排 除［1-2］。血小板特异性自身抗体的检测对ITP的诊断有重要的临床应用价值。目 前国内外针对血小板膜糖蛋白（GP）自身抗体的检测方法主要有单克隆抗体特异性 血小板抗原固定术（MAIPA）［3 ］和放射免疫微球法［4］等。本研究根据流式细胞技术 原理，应用本实验室制备的抗人血小板膜糖蛋白单克隆抗体，建立流式微球技术检 测血小板特异性自身抗体的方法，并对方法学及临床应用进行初步探讨。 1.1研究对象（1）初诊ITP组41例，男9例，女32例，年龄19~ 61岁（中位年龄 36岁），均符合美国血液病学会慢性ITP的诊断标准［5］。标本采集时患者血小板数 为（2~90）x109/L,未曾用激素、免疫抑制剂及脾脏切除等治疗；（2）非免疫性血 小板减少组（NITP）17例，男8例，女9例，年龄15~ 63岁（中位年龄32岁），包 括再生障碍性贫血5例，急性白血病9例，骨髓增生异常综合征3例，诊断符合 1998年《血液病诊断及疗效标准》（第3版）［6］; （3）对照组为35例健康志愿者， 年龄20 ~ 52岁（中位年龄35岁）,男12例女23例。 1.2仪器与试剂Cytomics FC-500流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）；聚苯乙 烯微球（直径18.39 pm,北京纳微科技公司）；抗GPIb单抗SZ2、抗GPHb单 抗SZ22和抗GPBa单抗SZ21（均由本实验室制备）；抗GPHb/Ba单抗7E3（比 利时Coller博士馈赠）；异硫氰酸荧光素标记羊抗人IgG抗体（FITC-GAH）、异硫 氰酸荧光素标记羊抗鼠IgG抗体（FITC-GAM）（Beckman Coulter公司）。 1.3微球包被利用物理吸附的原理包被聚苯乙烯微球，先将微球用丙酮预处理， 然后分别加入用包被缓冲液稀释好的SZ2、SZ22、SZ21、7E3单抗中，抗体包被 的终浓度分别为30、60、30. 20 pg/ml,4 °C摇床过夜。洗涤液（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤3次后，用20 g/L BSA/PBS封闭微球（室温摇床2 h）,洗 涤液洗涤3次后PBS重悬微球，使微球浓度为2 mg/ml ,4 C保存备用。用FITC 标记羊抗人IgG抗体和FITC标记羊抗鼠IgG抗体检测微球包被效果及稳定性。 1.4标本处理根据患者和健康人血小板计数，用含EDTA抗凝剂的硅化管采集外 周静脉血，轻轻混匀后800 r/min离心10 min，吸取上层富血小板血浆（PRP^ Eppendorf管，3 000 r/min离心10 min，分离上层血浆-20 C保存（供MAIPA 使用），沉淀用含0.5 g/L EDTA的