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内蒙古白绒山羊体细胞克隆技术的应用 由于高热、适应性强、遗传稳定等特点，山羊羊在国内外享有很高的声誉。山羊绒是世界上著名而稀有的特生动物纤维。它被称为“纤维钻石”和“软黄金”。应在颜色、长度和厚度上反映。羽毛越白、长度越细，质量越好。内蒙古天鹿羊具有独特的体貌美良、产量好、纤维软、长度好、亮度好、强度高、产茧率高等特点。利润高，肉质细腻。遗传稳定，适应性强，抗逆性强，是国际领导者。羊驼是内蒙古三大品种之一，品质优良，产茧性能好。成年公羊和山羊的平均产茧量从700g到900g之间，细度在14.5m到15m之间。年毛羊的平均产茧量在620g660g之间，细度约为13.13亿米。羊的产茧量在620g660g之间，细度约为13.5m。羊的品质是一个重要的羊皮纸育种技术。细度的变化直接影响到羊皮纸的产量。然而，由于小块组织的追求和山羊的产量，山羊的平均产量也在增加，超过17米。与此同时，优良菌株的数量逐年减少。从山羊到进口再到今天，中国也取得了很大的进步。自那列羊出生以来，山羊树干的研究一直是成功的。在这项研究之前，没有关于山羊牧羊的说法。本研究选取了内蒙古阿尔巴斯雄性白羊，平均产茧量近900g，13.9-14.6m。这是一位非常优秀的山羊。从耳边缘，它的组织和核心供应必须通过克隆技术进行。2009年4月30日，他诞生了一位名叫库克羊的山羊。现在，山羊羊的发育和生长良好。这些动物的丰富度和细节度呈现与细胞供应商一致的特征。 1 材料和方法 1.1 细胞复养液的制备 山羊卵巢收集自当地一屠宰场,置于25-30℃生理盐水中运回实验室.在TCM-199采卵液中用手术刀片划开卵巢表面可见卵泡,使卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus cell-enclosed oocyte complexes,COCs)释放出来,在实体显微镜下吸取具有完整卵丘细胞的卵母细胞,充分洗涤后放入成熟液中.成熟培养液为:TCM-199+10 mmol/L Hepes+10%FBS+0.01 IU/mL FSH+1 IU/mL LH+0.01μg/mL E2.在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养20-21 h. 1.2 细胞培养和分离 自内蒙古杭锦旗一种羊场选择1只优质雄性内蒙古阿尔巴斯白绒山羊.将其耳部表面羊毛剪干净,用75%酒精洗涤灭菌,剪0.5 cm2的一小块耳缘组织,置于PBS中带回实验室.将耳组织剪碎成约1 mm2大小的组织块,用吸管将剪碎组织块移入培养瓶中,均匀平铺于培养瓶底部.将培养瓶倒置,放到38.5℃培养箱内2h,使组织块牢固地贴附于培养瓶的底面,然后将培养瓶翻转,加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,在培养箱中继续培养,每隔两天更换新鲜培养液.待贴壁生长的细胞汇合度到达85%以上时,用PBS缓冲液将剩余组织块冲洗掉,再用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞,一部分继续传代培养,一部分冻存.传代至3-5代时作为核移植供体细胞,使用前用胰酶消化制成悬液. 1.3 细胞融合卵体的制备 卵母细胞成熟培养后,把COC用0.1%透明质酸酶经过涡旋振荡去除卵丘细胞.选取形态良好具有第一极体的成熟卵作为受体卵,放入显微操作液(TCM-199+25 mmol/L Hepes+5%FBS+7.5μg/mL细胞松弛素B)中.再用去核针吸取极体及附近质膜下包含染色体的少量细胞质进行去核,随后选取形态良好、中等大小的细胞注射到透明带与卵质膜之间,构建成待融合卵.再把操作完的待融合卵移入注满融合液的融合槽中,通过2次1.25 kV/cm,20μs的直流电脉冲进行融合. 1.4 卵裂、桑虾胚和囊胚发育的观察 将已经融合的胚胎经含5μmol/L离子霉素(ionomycin)的SOFaa培养液37℃处理5 min,然后转入含10μg/mL亚胺环己酮(CHX)中培养5 h.经过充分洗涤后,把克隆胚胎放入石蜡油覆盖下的25-30μL SOFaa培养液中,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养.分别在培养的第2、5和7天检查卵裂、桑椹胚和囊胚发育. 1.5 受体羊妊娠合并妊娠,术后6周内重建 选择本地山羊作为胚胎移植的受体.在克隆胚激活约20 h后,将处于1-至2-细胞期的克隆胚胎通过手术法移入同步发情受体山羊的输卵管内,每只受体羊移植8-10枚胚胎.胚胎移植后50-60天,利用B超诊断妊娠情况. 1.6 遗传一致性检测 使用Takara基因组DNA提取试剂盒提取供核体细胞系、克隆绒山羊、代孕母山羊和任意选取的普通山羊的基因组DNA,选取位于不同染色体上的9个微卫星多态性位点作为遗传标记,进行遗传一致性的检测(委托中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基因与细胞工程研究室完成). 2 结果 2.1 体外移植重构卵 为了观察绒山羊克隆胚胎体外发育情况,我们构建了核移植重