鸡腺胃型传染性支气管炎及大肠杆菌病二联灭活油乳剂苗的研究.docxVIP

鸡腺胃型传染性支气管炎及大肠杆菌病二联灭活油乳剂苗的研究 鸡腺胃状感染（ibv）和致癌性肠炎（e.coli）的血清型较多。不同地区的流行品种差异很大，给预防免疫预防带来了许多困难。同时, 由于鸡腺胃型传染性支气管炎易并发或继发大肠杆菌病, 使防治工作更加复杂化。为了更有效地防治这两种传染病, 作者进行了鸡腺胃型传染性支气管炎及大肠杆菌病二联灭活油乳剂苗的试制和应用研究。 1 中毒植物与幼苗前期的筛选 1.1 过滤原则 毒株或菌株对鸡胚或鸡均有强大的致病力, 故选择不同的血清型 (即有标准株, 又有地方分离株) , 以期研制免疫原性强的多价灭活苗。 1.2 鸡胚尿囊液的致死量和ha价检测 被筛选的IBV毒株为来源于中国兽药监察所M41和H52毒株, 河南地方鸡场分离鉴定的安阳株A1(呼吸型) 、郑州株Nz (腺胃型) 和新郑株Nx (腺胃型) 。 取上述5个IBV毒株的第5代鸡胚尿囊液各1份, 分别用灭菌生理盐水做1∶70稀释, 各接种10日龄鸡胚 (其亲代没有罹患腺胃型传染性支气管炎, 以及未进行过腺胃型传染性支气管炎疫苗的免疫) 10枚, 每枚接种0.2ml。接种后于24、36和48小时照蛋, 计算毒株对鸡胚的致死量, 结果见表1。取死亡胚经冷蛋收集尿囊液, 分别测其HA价, 结果见表2。剖检死亡胚可见有明显出血、蜷缩和大量尿酸盐沉积。 根据表1和表2的结果, 选取A1、Nz、Nx和M41株致命力强、血凝价高的IBV作为制苗的基础毒株。 1.3 血清型日龄插装菌感染第一、12株鸡的致病力检测 被筛选的菌株有来源于中国兽药监察所的3个菌株, 即44161、44115和44439, 血清型分别为O1、O2和O78, 还有河南各地鸡场分离鉴定的9个地方菌株, 即Z1、Z2、Z3、Z4、X1、X2、X3、X4、J6, 血清型分别为O2、O2、O78、O1、O2、O2、O1、O78、O2。 取上述菌株的24小时葡萄糖肉汤培养物0.2ml皮下或肌肉接种于1日龄雏鸡, 同时设阴性对照10只, 并严格隔离饲养。接种后观察7天, 对死亡雏鸡逐只剖检, 重新分离鉴定细菌, 从所有死亡雏鸡体内回收到大肠杆菌。并观察接种雏鸡12、24小时的发病死亡情况。 结果表明, 各菌株对1日龄雏鸡的致病力有较大差别。以接种后24小时对雏鸡的致死率为基础, 结合12小时的致死率来分析, 发现12株大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力以44115最强, 44161最弱。根据这一结果, 结合各株的血清型, 选用44115、44439、Z2、Z4、J6、X3等7株细菌作为制苗的基础菌株。 2 油乳液的开发 2.1 优样酒精袋溶液的制备 2.1.1 鸡碗 选用10～11日龄的鸡胚, 其亲代没有罹患过腺胃型传染性支气管炎等疾病, 也没有接种过任何支气管炎疫苗。 2.1.2 制苗毒种的制备 用筛选出的4个IBV基础毒株以及发病鸡场的分离毒株, 取其第5代鸡胚尿囊液, 每个毒株做1∶70的稀释, 接种后24～48小时内对鸡胚的致死率为100%, 经细菌检验为阴性者, 作为制苗种毒。 2.1.3 尿囊液的收集 将每批鸡胚平均分成若干组, 分别接种几株IBV种毒, 将每株种毒适当稀释后, 每胚接种0.2ml, 于37℃培养48小时, 弃去24小时内死胚, 将24～48小时死亡胚及时拣出, 收集死亡胚及病变胚的尿囊液;并将几株含毒的尿囊液混合, 灭活后加入甲醛使其最终浓度达0.2%, 于37℃作用24小时, 其间摇匀3～4次, 即成IBV多价灭活尿囊液。 2.1.4 无菌试验 取已灭活的IBV多价尿囊液0.2ml分别接种于普通肉汤、血液琼脂和厌氧肉肝汤培养基中, 37℃培养24～72小时, 均无菌生长。 2.1.5 鸡胚正常观察 取IBV多价灭活尿囊液用灭菌生理盐水作1∶10稀释, 接种10日龄鸡胚20枚, 每枚0.2ml, 连续观察3天, 鸡胚正常, 均无死胚及病变胚出现。 2.2 多价灭菌液的制备 将种子液以2%的比例接种于葡萄糖肉汤, 置37℃培养18～24小时。活细菌计数和纯检后, 加入最终浓度为0.4%的甲醛, 于37℃杀菌24小时, 其间摇匀3～4次, 即成E.coli多价灭菌液。取已灭活的菌液0.2ml, 分别接种于5ml葡萄糖肉汤、厌氧肉肝汤培养基中, 37℃培养24～72小时, 均应无菌生长。 2.3 ibv和e.coli含有两种联合化疗育苗苗的制备方法 2.3.1 水相苗的制备 取IBV多价灭活尿囊液与适量的E.coli多价灭活菌液混合, 按照一定的比例加入灭菌吐温—80, 充分搅拌, 使其溶解混匀。 2.3.2 二聚油乳液苗的制备 用水相苗按适当的比例加入油佐剂, 经高速搅拌乳化, 即成为乳白色的油乳剂苗。 2.4 次免疫攻毒 将20日龄罗曼鸡40只分成2组, 每只皮