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一种新型的ccf基因敲除菌的构建及鉴定 金霉素是一种重要的药物微生物。它的主要代谢产物是四环素、金霉素和脱甲基金霉素等4个抗生素。金色链霉菌基因组中含Ⅱ类PKS基因簇,可应用于组合生物学。目前该菌的遗传操作主要通过原生质体转化或电转化来完成。而接合转移可在一定程度上跨跃宿主的限制性屏障,是国内外研究的热点。本文以pJTU412为基本质粒,建立了适用于基因敲除的金色链霉菌接合转移体系,并在此基础上,成功构建了ctcF置换型菌株和框内缺失型菌株。 据报道,当ctcF在产6-去甲基四环素的金色链霉菌菌株中表达时,菌株的主要发酵组分由6-去甲基四环素变成四环素。本研究针对ctcF,以用于ctcF基因置换的质粒pFD109及用于ctcF基因框内缺失的质粒pFD111对金色链霉菌进行基因敲除,并对工程菌发酵组分进行分析,探究ctcF的功能。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 接合转移受体菌株 大肠杆菌 Top10为基因克隆受体菌,大肠杆菌ET12567(pUZ8002)为接合转移供体菌,金色链霉菌(S.aureofaciens)J13为接合转移受体菌,以上菌株均为作者实验室保存。质粒pFD104(含ctcF基因上游同源序列ctcF-1及ctcF基因下游同源序列ctcF-2)及质粒pKC1139均由作者实验室保存。复制型穿梭质粒pJTU412由福建师范大学李力老师惠赠,质粒1(ermE)由上海医药工业研究院邵雷博士惠赠。 1.1.2 酶和dna工具 限制性核酸内切酶、连接酶、rTaq酶和DNA Marker等均购于TaKaRa公司;DNA回收试剂盒购于上海生工;其它常规试剂参见文献。 1.1.3 麸皮、脂质和总乳酸钠 金色链霉菌固体培养基:(NH4)2HPO40.03%,KH2PO40.01%,MgSO4·6H2O 0.02%,麸皮 5.0%,琼脂 2.0%。细菌培养基为LB液体培养基。 LB培养基中抗生素终浓度:氨苄青霉素(Amp)100 μg/mL,安普霉素(Am)50 μg/mL,氯霉素(Cm)25 μg/mL,卡那霉素(Km)25 μg/mL;接合转移培养基中抗生素终浓度:安普霉素 25 μg/mL,红霉素(Ery)25 μg/mL,萘啶酸20 μg/mL。 1.2 方法 1.2.1 ctcf基因置换质粒及ctcf框内缺失质粒的构建 以pFD104、pKC1139、1及pJTU412为基础,构建ctcF基因置换质粒pFD109(ctcF-1,ctcF-2,EryR,AmR)及ctcF框内缺失质粒pFD111(ctcF-1,ctcF-2,EryR)。大肠杆菌感受态的制备和转化及常规的DNA克隆操作见文献。 1.2.2 lb培养基培养法 利用接合转移的方法将构建好的穿梭质粒导入到金色链霉菌中:供体ET12567(带pUZ8002与重组质粒)的过夜培养物转接到含抗生素的LB中,37℃培养至OD600为0.6时收集菌体,用新鲜LB培养基洗涤菌体2次后备用。将金色链霉菌孢子悬浮于5 mL、 0.05 mol/L、pH 8.0的TES缓冲液中,50℃水浴热激10 min,冷却至室温后加入等体积预萌发培养基,37℃振荡(250 r/min)培养2 h,离心收集孢子并重悬于适量的无菌水中,在混合器上振荡打散孢子,按细菌:链霉菌孢子为108:108进行等量混合,然后涂布于MS培养基上,16～18 h后用含1 mL的无菌水(含适量抗生素及萘啶酮酸)覆盖,置32℃培养3～4 d后即可看到抗性接合子。 1.2.3 选择和验证工程菌 用安普霉素或红霉素进行单、双交换菌落的表型筛选。提取链霉菌基因组DNA,利用PCR方法,对单交换、双交换菌落进行验证。 1.2.4 流动相-甲醇-水法降解高效液相柱温度,ldta,u HPLC色谱条件:welch公司Ultimate XB-C18(5 μm,4.6×250 mm);流动相 甲醇-水(25:75,含0.00 1mol/L EDTA,pH 6.6);检测波长:380 nm;流速:1 min/L;柱温:30℃。发酵液用0.22 μm的有机膜过滤。 2 结果与分析 2.1 ctcf框内缺失载体的构建 以pJTU412为出发载体,构建ctcF置换载体pFD109(图1),该质粒含ctcF两端的DNA序列ctcF-1和ctcF-2,作为同源交换臂;两交换臂之间插入抗性筛选标记ermE;交换臂外插入抗性筛选标记aac(3)Ⅳ。其酶切鉴定见图2,EcoRⅠ切下13 362 bp与1 168 bp条带,HindⅢ切下11 219 bp与3 311 bp的带,均与预测相符。 以pJTU412为出发载体,构建ctcF框内缺失载体pFD111(图3),该质粒含ctcF两端的DNA序列ctcF-1和ctcF-2,作为同源交换